京尼平苷酸對佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖及分泌細(xì)胞因子的影響Δ

金 鑫，朱 江，張煜偉，張 超（中國人民武裝警察部隊醫(yī)學(xué)院，天津市 300162）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是慢性關(guān)節(jié)病變的全身自身免疫性疾病，它以滑膜炎為特征，表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞類腫瘤樣增生。筆者前期研究[1～3]表明，梔子浸膏及其單體京尼平苷能夠抑制RA大鼠足腫脹并下調(diào)血清中致炎因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平，提示該藥物可能對RA有治療作用。京尼平苷酸（GA）是京尼平苷的衍生物，GA可抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠繼發(fā)性炎癥，降低血清中TNF-α、IL-1β水平，體外可誘導(dǎo)AA大鼠滑膜細(xì)胞細(xì)胞凋亡[4]。本文通過觀察GA對體外培養(yǎng)AA大鼠滑膜細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10及細(xì)胞周期的影響，進(jìn)一步探討該藥物的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

TS100型倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；3110型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司）；SUNRISE型酶標(biāo)儀（奧地利Tecan公司）；EPICS XL型流式細(xì)胞儀（美國Coulter公司）。

1.2 試藥

京尼平苷酸（成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司，批號：含量（HPLC法）：≥98%）；注射用甲氨喋呤（MTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：07102412，規(guī)格：每支5 mg）；凍干卡介苗（北京生物制品研究所，批號：20080129，規(guī)格：每支60 mg）；弗氏不完全佐劑、Ⅰ型膠原酶、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、MTT（美國Sigma公司）；TNF-α、IL-1β和IL-10酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢博士德公司，批號：EK0526、EK0393、EK0418）；兔抗Vimentin蛋白抗體（北京博奧森生物有限公司，批號：bs-0756R）；兔SP免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，批號：K86922E、290573）。

1.3 動物

健康Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量180～200 g，北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司提供（動物合格證號：SCXK（京）2007-0001）。

2 方法

2.1 模型的建立[5]

用弗氏完全佐劑（卡介苗80℃、1 h滅活，與弗氏不完全佐劑充分乳化，含卡介苗10 g·L－1）于大鼠右后足跖皮內(nèi)注射0.1 mL致炎，用關(guān)節(jié)炎指數(shù)[4]評定大鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度，于注射弗氏完全佐劑后第25天篩選關(guān)節(jié)炎指數(shù)在3分以上的大鼠進(jìn)行滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

2.2 大鼠滑膜組織的分離與滑膜細(xì)胞培養(yǎng)

取造模成功大鼠，脫臼處死，置于75%乙醇浸泡2 min，局部乙醇消毒于膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚，分離肌肉露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離，可見平滑光亮的滑膜組織，用手術(shù)剪分離關(guān)節(jié)囊的纖維層和滑膜層，取出滑膜層組織，同法采集另一側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜層組織。將滑膜組織在D-Hanks液中漂洗3次，去除脂肪組織，剪成1 mm3的小塊，用0.2%的Ⅰ型膠原酶消化4 h，離心去上清后用0.25%胰酶消化30 min，200目濾網(wǎng)過濾，濾液離心后細(xì)胞沉淀用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取2～3代細(xì)胞用于試驗。

2.3 原代成纖維樣滑膜細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

將2～3代滑膜細(xì)胞制成1×106個·L－1細(xì)胞懸液，在6孔板內(nèi)爬片培養(yǎng)，棄上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，冷甲醇固定15 min，PBS洗滌，滴加3%H2O2滅活內(nèi)源性酶15 min，PBS洗滌，羊血清封閉20 min后，滴加兔抗VimentinⅠ抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌，滴加羊抗兔Ⅱ抗37℃孵育1 h，PBS洗滌，滴加鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）37℃30 min，DAB顯色，自來水清洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，鏡下觀察陽性細(xì)胞數(shù)量和純度。

2.4 分組與加藥

將處于對數(shù)生長期的滑膜細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化制成所需濃度的細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后換含1%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化，細(xì)胞分組加藥處理，進(jìn)行指標(biāo)檢測，細(xì)胞分為GA高、中、低（10－5、10－6、10－7mol·L－1）濃度組、陽性對照組（MTX，10－6mol·L－1）和對照組（等體積生理鹽水）。

2.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖

滑膜細(xì)胞制成1×106個·L－1細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，分組及給藥方法同“2.4”項，每組設(shè)8個復(fù)孔。分別于給藥后1、3、5 d測定細(xì)胞增殖情況，每孔加MTT（5 g·L－1）20 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清，將板晾干，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL在搖床上震蕩15 min，以570 nm為測量波長，630 nm為參比波長用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度（A值），以A值代表細(xì)胞增殖能力。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期

滑膜細(xì)胞制成1×106個·L－1細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，按“2.4”項下方法分組給藥，每組3個復(fù)孔，藥物處理48 h后，常規(guī)方法收集細(xì)胞，離心棄上清，PBS洗1次，每管加70%乙醇1 mL固定，用吸管將細(xì)胞分散成單個，－20℃過夜。離心棄固定液，加50 mg·L－1RNA酶A（Rnase）37 ℃孵育 1 h，加50 mg·L－1碘化丙啶（PI）染液，4 ℃避光1 h，400目的篩網(wǎng)過濾1次，在流式細(xì)胞儀上測定不同細(xì)胞周期的細(xì)胞比例（G1期為DNA合成前期，S期為DNA合成期，G2期為DNA合成后期，M期為有絲分裂期）。

2.7 ELISA法檢測滑膜細(xì)胞外液中IL-1β、TNF-α、IL-10水平

調(diào)整滑膜細(xì)胞密度為3×106個·L－1，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，按“2.4”項下方法分組，各加藥組在含藥培養(yǎng)基中另加LPS，濃度為5 mg·L－1，目的為刺激滑膜細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。加藥處理48 h后，收集細(xì)胞上清，參照ELISA試劑盒說明書測定各組滑膜細(xì)胞外液中IL-1β、TNF-α、IL-10的水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗和單因素方差分析，數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件分析，以P＜0.05為差異具有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 成纖維樣滑膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察和鑒定

體外培養(yǎng)的原代滑膜細(xì)胞根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征，可分為3種類型：（1）巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞；（2）成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）；（3）樹突狀細(xì)胞。滑膜細(xì)胞在體外培養(yǎng)通過幾次傳代后主要以梭形的FLS為主，光鏡下細(xì)胞呈長梭形，兩極胞突細(xì)長，末端多與鄰近細(xì)胞連接并交織成網(wǎng)狀，細(xì)胞核呈卵圓形位于細(xì)胞中央，細(xì)胞較薄，透亮，排列有局部方向性，F(xiàn)LS光鏡圖見圖1。Vimentin蛋白是中胚層組織細(xì)胞特征性蛋白，可用于FLS的鑒定，結(jié)果可見2～3代滑膜細(xì)胞大多數(shù)為FLS，純度達(dá)到試驗要求，Vimentin染色圖見圖2。

圖1 FLS光鏡圖（×200）Fig 1 FLS light micrograph（×200）

圖2 FLS免疫組化Vimentin染色圖（×100）Fig 2 Immunohistochemistry Vimentin staining of FLS（×100）

3.2 細(xì)胞增殖情況

不同濃度GA連續(xù)給予5 d，A值降低。與對照組比較，GA高劑量組和陽性對照組大鼠滑膜細(xì)胞A值顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），表明GA在體外可抑制AA模型大鼠滑膜細(xì)胞增殖，抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性增強(qiáng)。各組大鼠滑膜細(xì)胞增殖情況見表1。

表1 各組大鼠滑膜細(xì)胞增殖情況（A，±s，n＝8）Tab 1 Proliferation of synoviocytes in each group（A，±s，n＝8）

與對照組比較：＊P＜0.05，#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，#P＜0.01

組別1 d 3 d5 d對照組0.339 7±0.014 00.480 2±0.017 50.613 8±0.030 6 GA高濃度組0.301 8±0.027 7＊0.447 2±0.023 5＊0.533 8±0.029 6#GA中濃度組0.311 0±0.032 40.461 7±0.036 40.579 7±0.023 7 GA低濃度組0.327 3±0.032 30.469 0±0.0330.584 5±0.016 4陽性對照組0.207 5±0.022 2#0.175 5±0.020 2#0.156 7±0.028 3#

3.3 細(xì)胞周期情況

不同濃度藥物處理細(xì)胞48 h后，與對照組比較，GA高、中濃度組大鼠G1期滑膜細(xì)胞比例明顯增加，S期和G2/M期滑膜細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.01）；陽性對照組大鼠G1期滑膜細(xì)胞比例明顯增加，S期滑膜細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.01），G2/M期滑膜細(xì)胞比例沒有明顯改變，表明GA能夠阻滯G1期細(xì)胞向S期移行，阻滯DNA合成和復(fù)制，從而抑制滑膜細(xì)胞增殖。各組大鼠滑膜細(xì)胞周期分布變化情況見表2。

表2 各組大鼠滑膜細(xì)胞周期變化情況（±s，n＝3）Tab 2 Cell cycle of synoviocytes in each grou（p±s，n＝3）

與對照組比較：＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01

細(xì)胞周期分布/%組別對照組GA高濃度組GA中濃度組GA低濃度組陽性對照組G1S G2/M 10.7±1.9 5.6±0.5＊5.9±0.7＊9.9±1.3 10.9±1.7 74.7±1.9 84.9±2.2＊84.6±3.6＊75.7±2.6 84.2±3.9＊14.7±1.9 9.5±2.2＊9.4±2.6＊14.4±3.3 4.9±0.7＊

3.4 IL-10、IL-1β、TNF-α變化情況

與對照組比較，GA高濃度組與陽性對照組TNF-α、IL-1β水平明顯降低，IL-10水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），GA中濃度組TNF-α水平降低、IL-10水平升高（P＜0.05），表明GA能通過抑制滑膜細(xì)胞分泌致炎因子，增加抑炎因子的分泌，阻止或緩解關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生和發(fā)展。各組大鼠滑膜細(xì)胞外液TNF-α、IL-1β、IL-10變化情況見表3。

表3 各組大鼠滑膜細(xì)胞外液TNF-α、IL-1β、IL-10的變化情況（±s，n＝4）Tab 3 Levels of TNF-α，IL-1β and IL-10 in extracellular fluid of synoviocyte（s±s，n＝4）

表3 各組大鼠滑膜細(xì)胞外液TNF-α、IL-1β、IL-10的變化情況（±s，n＝4）Tab 3 Levels of TNF-α，IL-1β and IL-10 in extracellular fluid of synoviocyte（s±s，n＝4）

與對照組比較：＊P＜0.05，#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，#P＜0.01

組別對照GA MTX IL-10/ng·L－1 21.37±9.05 43.38±11.82#35.01±10.69＊23.83±10.23 45.19±10.98#濃度/mol·L－1-10－5 10－6 10－7 10－6 TNF-α/ng·L－1 40.98±9.24 26.38±8.83#32.19±5.59＊34.82±11.26 25.18±9.22#IL-1β/ng·L－1 58.47±10.08 44.39±9.46＊47.52±11.02 52.71±13.33 43.96±10.61＊

4 討論

RA的基本病理改變是滑膜炎，常導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞、畸形，最終導(dǎo)致不同程度的功能障礙，患病率居自身免疫性結(jié)締組織病首位。目前治療RA主要是采取西藥來控制和緩解癥狀，但副作用大，且無根治作用；中藥治療多采取復(fù)方制劑，但存在物質(zhì)基礎(chǔ)不清，單體療效及作用機(jī)制不明等問題。中藥梔子系茜草科植物的成熟果實(shí)，有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒功效。GA為梔子提取的單體，是京尼平苷衍生物，可由京尼平苷酯解產(chǎn)生，由于二者化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，由構(gòu)效關(guān)系推測GA可能具有相似的抗炎作用。

RA的發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，除與免疫功能失調(diào)相關(guān)外，過度增生的滑膜細(xì)胞功能改變在關(guān)節(jié)損傷和組織重構(gòu)中起著至關(guān)重要的作用。文獻(xiàn)[6，7]報道RA滑膜細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特性，引起RA關(guān)節(jié)滑膜組織炎性增生的基本原因可能是由于滑膜細(xì)胞凋亡機(jī)制障礙，引起細(xì)胞增殖和凋亡失平衡所致。

在RA中多種炎癥介質(zhì)參與了關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)展過程，其中TNF-α和IL-1β是參與RA發(fā)病的主要的細(xì)胞因子，在關(guān)節(jié)損傷中起重要作用[8]。RA的關(guān)節(jié)液中可檢測出高水平的IL-1，IL-1可促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)前列腺素E和膠原酶的產(chǎn)生，是RA軟骨降解和骨破壞的主要細(xì)胞因子之一[9]。TNF-α通常和IL-1表現(xiàn)出協(xié)同性生物學(xué)效應(yīng)，TNF-α可以調(diào)節(jié)IL-1分泌，上調(diào)RA滑膜細(xì)胞分泌膠原酶、金屬蛋白酶、環(huán)氧化酶和前列腺素E2，導(dǎo)致滑膜炎癥、軟骨破壞，造成關(guān)節(jié)損傷[10]。IL-10是重要的炎癥抑制因子，具有很強(qiáng)的免疫抑制及免疫調(diào)控作用，提示它在RA的發(fā)病中起著一定保護(hù)作用[11]。IL-10可抑制有核細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α及粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等而表現(xiàn)其抗炎作用；亦可刺激B細(xì)胞成熟和活化分泌多種抗體，如IgM、IgA；同時誘導(dǎo)合成Bcl-2蛋白，阻斷B細(xì)胞凋亡而達(dá)到抗炎作用。

本試驗研究表明，GA在體外可以抑制AA大鼠FLS增殖，抑制作用呈藥物劑量依賴性增強(qiáng)，其機(jī)制與阻滯細(xì)胞周期G1期向S期移行、阻滯DNA合成和復(fù)制有關(guān)；GA還可以下調(diào)FLS分泌致炎因子TNF-α、IL-1β水平，而上調(diào)抑炎因子IL-10水平，這些可能是其抗RA的作用機(jī)制之一。

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