阿霉素誘導非缺血性心肌病模型小鼠方法的建立及其可行性評價

黃楚珠，黃偉哲，梁結玲，肖大偉（汕頭大學醫學院第一附屬醫院，汕頭市 515041）

阿霉素是蒽環類抗腫瘤藥物，它能產生氧自由基而誘導心肌細胞凋亡，常被用于誘導非缺血性心肌病模型。目前國內、外多采用兔、大鼠[1]作為阿霉素的誘導對象，但由于采用這2種動物為對象具有體質量大、用藥多、費用高、誘導心肌病模型的時間過長（一般8～12周）的缺點，為此，筆者采用小鼠作為誘導對象，必將節省大量費用。本研究通過一次性注射大劑量阿霉素的方式，短時間內建立小鼠非缺血性心肌病模型，并用高頻率超聲心動圖評價其可行性。

1 材料

1.1 動物

BALB/c小鼠78只，♂，體質量22～24 g，周齡8～12周，由香港中文大學動物實驗中心提供，動物實驗合格證號：2005A018。

1.2 試藥

阿霉素注射液（澳洲Ebewe公司，批號：406151，規格：2 mg·L－1）。

1.3 儀器

SONOS7500多普勒超聲診斷儀（美國飛利浦公司）；AxioplanⅡimaging熒光相差倒置顯微鏡（德國Zeiss公司）；TECNAI10透射電子顯微鏡（荷蘭飛利浦公司）。

2 方法

2.1 超聲心動圖檢查

小鼠隨機分為對照組和給藥組，各39只。給藥前所有小鼠均接受超聲心動圖檢查，獲取基礎狀態超聲指標。給藥組經腹腔一次性注射阿霉素20 mg·kg－1[2]，對照組注射同容量的生理鹽水。2組在給藥后第3、4、5天進行超聲心動圖檢查，測定各項指標。超聲檢查前2～3 d重復訓練清醒狀態下的小鼠[3]。訓練方法：左手捉鼠，右手將探頭固定于小鼠左胸前壁，模仿超聲過程，一般重復6～8次，直至小鼠心率穩定于540～650次·min－1，隨后剔除左胸前壁鼠毛。實驗超聲檢查由2人完成，一人捉鼠并固定探頭，另一人操作機器。基礎狀態下和注射阿霉素后第3、4、5天檢查小鼠，探頭放置于左胸前壁，切取滿意的左室長軸切面后，在乳頭肌水平將M型取樣線垂直于左室后壁而獲得M型超聲心動圖，隨即獲取主動脈流速曲線。獲取的超聲圖像傳送至工作站保存，并由2位未參與試驗的超聲師行數據統計分析。選取3個連續心動周期，采用美國超聲心動圖協會推薦方法進行測量，測量數據包括：舒張末期左室內徑（LVEDD）、收縮末期左室內徑（LVESD）、心率（HR），左室收縮功能由左室短軸縮短率（FS）和每分鐘輸出量（CO）評價。HR由主動脈多普勒血流信號測量。FS和CO由以下公式 計 算 ：FS＝（LVEDD － LVESD）/LVEDD；CO＝HR ×（LVEDD3－LVESD3）。

2.2 組織學檢查

超聲檢查完畢后在第5天處死所有小鼠，取心臟，稱重，取左心室中上1/3切面，10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，5 μm切片，HE染色。于40×10倍熒光相差倒置顯微鏡下根據Billingham推薦方法評價每只小鼠心肌的病變程度[4]，即根據心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失占所取切面的百分數進行評分，隨后取各組評分的中位數：0分表示切面未見心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失；1分表示心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失占切面＜5%；1.5分表示心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失占切面5%～15%；2.0分表示心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失占切面16%～25%；2.5分表示心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失占切面26%～35%；3分表示心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失占切面＞35%。

2.3 電鏡檢查

取小鼠的左心室游離壁中上1/3心肌標本，放置4%戊二醛固定0.5 h，制作成體積約1 mm3的樣本，送電鏡室，用2%四氧化鋨（pH 7.2），雙重固定2 h，梯度丙酮（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15 min；100%丙酮2次，各10 min）脫水，環氧樹酯包埋，半薄切片經甲苯胺藍染色后，再行超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重電子染色。部分標本醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色行透射電鏡觀察[5]。在透射電子顯微鏡下觀察細胞核、線粒體、肌絲及新生的異常結構。

2.4 統計學處理

超聲測量值以均數±標準差表示，2組間比較采用Student T-test，組織學病理評分以中位數表示，與心功能測量值關系采用Pearson相關分析。

3 結果

3.1 一般情況

對照組均存活，無異常改變，第5天稱得心臟重量為（0.149±0.005）g。給藥組小鼠普遍出現厭食、體質量下降、活動減少，第4、5天小鼠存活只數分別為36、30，第5天給藥組小鼠心臟重量為（0.108±0.012）g，有顯著性差異（P＜0.05）。

3.2 超聲心動圖檢查結果

對照組在不同時間點的超聲指標均穩定。給藥組小鼠HR僅在第1天內有微弱升高趨勢，隨后下降，第3、4、5天均降低，與當天對照組比較有顯著性差異（P＜0.05或（P＜0.01）。給藥組FS在第3、4、5天呈下降趨勢，第5天與當天對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。給藥組CO在第4天即明顯下降，與當天對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；給藥組LVEDD在第5天明顯減少，與當天對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。具體結果見表1（第0天n＝39；給藥組第4天n＝36，第5天n＝30）。

表1 各組小鼠超聲心動圖檢測結果（±s）Tab 1 Ultrasonic echocardiogram of each grou（p±s）

表1 各組小鼠超聲心動圖檢測結果（±s）Tab 1 Ultrasonic echocardiogram of each grou（p±s）

與同一天對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.control group at the same day：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

參數HR/次·min－1 LVEDD/cm LVESD/cm FS/%CO/mL·min－1對照組給藥組第0天579±15 0.294±0.014 0.126±0.015 56.7±4.3 13.2±3.0第3天585±11 0.284±0.022 0.123±0.017 56.4±3.6 12.1±3.4第4天581±14 0.286±0.018 0.131±0.022 54.2±4.5 11.3±2.8第5天580±17 0.294±0.013 0.128±0.017 56.5±3.9 12.5±2.5第0天586±23 0.298±0.019 0.128±0.020 57.0±3.9 13.3±2.7第3天567±31＊0.272±0.022 0.126±0.028 54.0±4.5 9.8±3.3第4天529±32＊0.253±0.047 0.126±0.031 50.2±5.6 7.5±2.3＊第5天478±30＊＊0.227±0.051＊＊0.125±0.036 44.3±6.1＊4.7±2.0＊

3.3 HE染色光鏡檢查

對照組胞漿豐富，肌纖維排列整齊；病理評分中位數均為0。給藥組心肌損傷明顯，細胞內空泡形成，肌纖維斷裂、排列紊亂，細胞間隙水腫；第5天病理評分中位數為2.5。各組小鼠心肌細胞HE染色圖見圖1，給藥組小鼠第5天病理評分見表2。

3.4 第5天電鏡檢查

對照組肌絲完整，線粒體未見異常；給藥組可見肌絲排列紊亂，部分肌絲溶解，髓樣結構形成，線粒體腫脹，線粒體嵴模糊。各組小鼠心肌細胞電鏡檢查圖見圖2。

4 討論

阿霉素通過激活一氧化碳合成酶、結合三價鐵和誘生過氧化氫等多種機制，促使心肌細胞內產生大量氧自由基，導致細胞凋亡[5]。注射20 mg·mL－1阿霉素后第24小時，即能發現Tunnel陽性的小鼠心肌凋亡細胞顯著增多[6]。

本研究進一步顯示，一次性腹腔注射20 mg·mL－1阿霉素，能在小鼠上建立穩定的非缺血性心肌病模型。組織病理切片示心肌纖維斷裂、胞內空泡化，電鏡下見線粒體腫脹、部分肌絲溶解，均屬阿霉素心臟毒性的典型表現[7]。給藥組的第5天心肌Billingham評分均在1.5分以上，證實阿霉素的心肌損傷充分、可靠；給藥組的第4、5天小鼠存活數量足夠接受檢查。給藥組小鼠FS減少，CO及心率下降，符合心功能不全的典型表現，與國外其它實驗組的結果一致[8，9]。

高頻率超聲心動圖能監測心肌病小鼠的心功能改變。本研究采用飛利浦公司提供的6～15 MHz線陣探頭，檢查頻率設定為15 MHz，橫向分辨率和縱向分辨率在理論上可達0.02、0.001 mm[10]，足以提供清晰的超聲圖象。此外，對照組在3、4、5 d測量的數值皆均勻一致，離散趨勢小；相應給藥組的心功能指標隨時間變化逐漸偏低，符合病程變化，說明高頻率超聲心動圖確能有效地評價該心肌病模型。

HR、CO、FS與相應的心肌病理評分相關系數依次為0.934（P＜0.001）、0.842（P＜0.001）、0.765（P＜0.01）。與CO 和FS比較，HR與組織學病理評分之間的相關系數最大，測量值變異系數最小，可見HR是評價心肌病模型的最敏感指標，追蹤該模型HR的改變是必不可少的。第5天給藥組各心功能指標均顯著下降，電鏡檢查顯示肌纖維內出現典型的阿霉素心肌毒性改變，說明給藥后第5天心肌病模型已經成功建立。

本實驗所測得的小鼠LVEDD減少，與長時間阿霉素誘導的擴張型心肌病表現不符，可能是小鼠心臟重量急劇減輕所致，該結果與其它實驗組的結果一致[8]。

阿霉素短時間內能在小鼠上誘導出心肌病心衰模型，該模型具有經濟、可靠、省時等優點，同時，使用高頻率超聲心動圖評價該模型建立成功。

（致謝：本研究部分在香港中文大學兒科學系宋銀子教授指導并幫助下完成，特致謝！）

表2 給藥組小鼠第5天病理評分（n＝30）Tab 2 Pathologic scores of administration group on the fifth day（n＝30）

圖1 各組小鼠心肌細胞HE染色圖（10×40）A.對照組；B.給藥組Fig 1HE staining of myocardium of each grou（p10×40）A.control group；B.administration group

圖2 各組小鼠心肌細胞電鏡檢查圖（×8 000）A.對照組；B.給藥組Fig 2 Electron microgram of myocardium of each group（ ×8 000）A.control group；B.administration group

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