HPLC 法測定大鼠肝微粒體中睪酮的含量

夏宗玲，陳榮，鄒素蘭，王明麗（江蘇常州市第一人民醫院藥劑科，常州市213000）

目前已發現與藥物代謝密切相關的細胞色素P450酶（CYP450）主要有CYP1～4[1]，其中以CYP3A亞族最為重要，占人肝臟CYP450總量的30%，主要成員包括CYP3A3、CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7，成人肝臟中以CYP3A4為主[2]。CYP3A4的底物較多，據統計大約38個類別共150多種藥物是其底物[3]，約占全部藥物的50%，因此能夠準確地評價CYP3A4的酶活性對藥物相互作用研究以及臨床合理用藥都是十分重要的。目前國內、外多采用睪酮作為CYP3A4的探針底物[4，5]，通過測定肝微粒體體外代謝反應過程中睪酮的減少量或其代謝產物6-羥基睪酮的生成量來評價該酶的活性。文獻[6，7]報道的高效液相色譜（HPLC）法多采用外標法測定，由于操作過程復雜，從而影響了睪酮的定量，較難準確評價CYP3A4的活性。本研究在借鑒前人研究的基礎上，簡化了樣品處理方法，采用內標法建立了一種快速、高效、穩定的測定大鼠肝微粒體溫孵體系中睪酮含量的HPLC法。

1 材料

1.1 儀器

HPLC系統，包括2996紫外檢測器、1525雙元梯度泵、717自動進樣器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，精密度：1×10－5g）；5417R高速臺式離心機（德國Effendorf公司）；低溫冰箱（日本Sanyo公司）；旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；恒溫振蕩水槽（上海精宏儀器設備有限公司）；雪花制冰機（北京長流科學儀器公司）。

1.2 試藥

睪酮對照品（常州佳爾科藥業集團有限公司提供，批號：090301，純度：99.3%）；地西泮標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：230-9601，供含量測定用）；乙腈為色譜級；枸櫞酸三鈉鹽、枸櫞酸脫氫酶、氧化/還原型輔酶Ⅱ均購于Sigma-Aldrich（上海）試劑公司。

1.3 動物

Sprague-Dawley（SD）大鼠，♂，體質量200～250 g，月齡1.5個月，合格證號：SCXK（滬）2003-0003，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Ultimate-XB C18（250 mm×4.6 mm，4 μm），流動相為水-乙腈（50∶50，V/V），內標為地西泮，流速為1.0 mL·min－1，檢測波長為245 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。取空白微粒體、空白微粒體+睪酮+內標、37℃下睪酮代謝15 min后的微粒體樣品（含地西泮）進樣測定，記錄色譜，結果詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白微粒體；B.空白微粒體+睪酮+地西泮；C.微粒體樣品；1.代謝產物；2.睪酮；3.地西泮Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank microsome；B.blank microsome+testosterone+diazepam；C.microsomes sample；1.metabolite；2.testosterone；3.diazepam

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液：精密稱取睪酮對照品約28.836 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻得濃度為10 mmol·L－1的對照品溶液，待用。

2.2.2 內標溶液：精密稱取地西泮標準品5.4 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻得濃度為200 μg·mL－1的內標溶液，待用。

2.2.3 再生系統溶液：枸櫞酸三鈉鹽2.8 mg，枸櫞酸脫氫酶0.5 mg（相當于10 u），0.15 mol·L－1氯化鎂0.1 mL，0.1 mol·L－1三羥甲基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）緩沖液（pH 7.4）0.9 mL，混合，可根據需要按比例制備一定量，臨用新配。

2.3 微粒體的制備

取SD大鼠，斷頭后打開腹腔暴露出肝臟，用冰浴冷卻的生理鹽水經胸動脈或門靜脈注入肝臟，直至肝臟顏色變黃后取出肝臟浸入冰冷的生理鹽水中，洗去血水（均在4℃以下操作）。濾紙吸干水分，稱重后加入4倍于肝重的0.25 mol·L－1蔗糖溶液，制成勻漿，于9 000 r·min－1離心20 min，取上清液于19 000 r·min－1離心20 min，分取上清液，加入1/10體積的88 mol·L－1氯化鈣溶液，置于冰浴中5 min，不時攪拌，于27 000 r·min－1離心20 min，除去上清液，在沉淀物中加入pH 7.4的0.1 mol·L－1Tris-KCl緩沖液（含0.15 mol·L－1KCl）混勻，27 000 r·min－1離心30 min，取沉淀物加pH 7.4的50 mmol·L－1Tris-蔗糖緩沖液制成微粒體懸浮液，于－80℃下保存備用。以BCA（Bicinchoninic aicd）法測定微粒體中的蛋白濃度。

2.4 生物樣品處理

取大鼠肝微粒體適量，用新鮮制備的枸櫞酸-枸櫞酸脫氫酶再生系統溶液稀釋成蛋白濃度為1.0 mg·mL－1的混合懸液，充氧氣2 min，取此混懸液0.2 mL，加對照品溶液2 μL，混勻，預孵5 min后，加氧化/還原型輔酶Ⅱ的0.1%NaHCO3溶液（臨用新配，置于冰浴中，終濃度為0.25 mmol·L－1/0.1 mmol·L－1）啟動反應，并開始記時，孵育一定時間后加冰冷的乙腈0.2 mL（含20 μL地西泮，終濃度為10 μg·mL－1）終止反應，渦旋1 min，15 000 r·min－1離心10 min，取上清液20 μL進樣，測定代謝反應完成后剩余CYP3A4底物睪酮濃度。

2.5 標準曲線的制備

取對照品溶液制備成不同濃度的溶液，依次取2 μL加入經60℃加熱失活的大鼠肝微粒體中至200 μL，分別制備成濃度為10.0、25.0、50.0、75.0、200 μmol·L－1的生物標準品（每個濃度平行3份，同時做空白對照），加20 μL的內標溶液，180 μL乙腈沉淀蛋白，旋渦振搖1 min，15 000 r·min－1離心10 min，取上清液20 μL進樣，進行色譜分析。以睪酮峰面積與地西泮峰面積的比值（R）對濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程：R＝0.025 7X+0.035 3（r＝0.999 5）。結果表明，睪酮在10.0～200.0 μmol·L－1濃度范圍內與R有良好的線性關系。本實驗睪酮最低檢測濃度為0.76 ng。

2.6 回收率試驗

取對照品溶液制備成不同濃度的溶液，依次取2 μL加入經60℃加熱失活的大鼠肝微粒體中至200 μL，分別制備成濃度為15.0、50.0、100.0 μmol·L－1的生物標準品（每個濃度平行5份，同時做空白對照），按“2.5”項下方法處理，進行色譜分析，計算方法回收率（即將所得信號值代入回歸方程，求得測定值，與加入量比較）及相對回收率（即測得睪酮和內標峰面積的比值與相同濃度的睪酮和內標的純溶液的峰面積比值比較），結果見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝5）Tab 1 Results of recovery tes（tn＝5）

2.7 精密度試驗

取“2.6”項下低、中、高（15.0、50.0、100.0 μmol·L－1）濃度的生物標準品（每個濃度平行5份，同時做空白對照），按“2.5”項下方法處理，分別在同日內測定5次（每隔1 h測定1次）和連續測定5 d（每天同一時間每個濃度平行測定5份），計算日內、日間RSD，結果見表2。

表2 精密度試驗結果（n＝5）Tab 2 Results of precision test（n＝5）

2.8 CYP3A4活性測定

分別取大鼠肝微粒體適量，加入2 μL一定濃度的睪酮溶液，使其終濃度為25 μmol·L－1，加入枸櫞酸-枸櫞酸脫氫酶適量，預孵5 min后，加氧化/還原型輔酶Ⅱ的0.1%NaHCO3溶液5 μL（臨用新配，置于冰浴中，終濃度為0.25 mmol·L－1/0.1 mmol·L－1）啟動反應，并開始記時，37 ℃下分別孵育5、10、15 min后，按“2.4”項下方法加冰冷的乙腈處理后，取上清液20 μL進樣，根據以下公式依次計算出代謝量、反應率及反應速度，結果見表3。

表3 不同反應時間下大鼠肝微粒體中CYP3A4活性測定結果（n＝3）Tab 3 Determination results of CYP3A4 activity in mice liver microsomes at different reaction time（n＝3）

W＝W0－Wt（W：代謝量；W0：初始加入睪酮的量；Wt：反應t時間后剩余睪酮的量）

由表3可見，隨著反應時間的延長反應率直線增加，反應速度略有增加但無顯著性差異（P＞0.05），表明所制備的大鼠肝微粒體中CYP3A4活性穩定可靠，可用于藥物體外代謝研究。

3 討論

近年來新藥上市后因發生代謝性相互作用原因而退出市場的情況時有發生[8]，因此了解藥物代謝性相互作用已成為醫務人員及患者的迫切要求。為了避免因藥物代謝性相互作用而引起的嚴重不良反應的發生，藥物代謝的研究越來越引起廣大科研人員的重視，目前美國食品與藥品管理局（FDA）已規定新藥在上市前必須做其代謝研究。由于大部分藥物都是通過CYP450酶催化代謝的，因此通過探針底物測定CYP450酶的活性尤其重要。

CYP3A亞族催化大部分藥物的氧化代謝，而其中也有較多是用于體內外分析酶活性的探針底物，如用N-甲基14C標記的紅霉素測定CYP3A4[9]，但這種方法對儀器設備要求較高，一般實驗室較難達到，故本論文采用睪酮作為探針底物，建立了一種快速、靈敏、準確測定睪酮含量的高效液相色譜法，此法可用于CYP3A4活性的測定。

在內標物的選擇上，筆者考察了地塞米松、甲睪酮、氫化可的松、可的松、胺碘酮、卡馬西平、米達唑侖、茶堿、苯妥英鈉等，最終發現地西泮無論在出峰時間、峰形，還是分離度方面都是最佳選擇。

在反相液相色譜條件下，乙腈洗脫能力優于甲醇，可以得到相對較高柱效的睪酮峰，且使睪酮與內標得到很好分離，故選擇乙腈-水＝50∶50的比例作為流動相。

[1]Nelson DR，Kamataki T，Waxman DJ，et al.The P450superfamily：update on new sequences，gene mapping，accession numbers，early trivial names of enzymes，and nomenclature[J].DNA Cell Biol，1993，12（1）：1.

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[3]Yamano S，Tatsuno J，Gonzale FJ.The CYP2A3 gene product catalyzes coumarin 7-hydroxylation in human liver microsomes[J].Biochemistry，1990，29（5）∶1 322.

[4]Caroline AL，Sue HK，Thomas AK，et al.CYP3A4 expressed by insect cells infected with a recombinant baculovirus bontaining both CYP3A4 and human NADPH-cytochrome P450reductase is catalytically similar to human liver microsomal CYP3A4[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1995，319（1）：157.

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[6]張 榮，劉昌輝，王寧生，等.以睪酮為探針采用高效液相色譜法測定細胞色素CYP4503A4的酶活性[J].色譜，2008，26（1）：80.

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