HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中芬太尼濃度及其代謝機(jī)制研究

向榮鳳，陳勇川，楊 波，夏培元（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥劑科，國家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，重慶市 400038）

芬太尼（Fentanyl）為一種阿片類止痛劑，主要與μ-阿片受體相互作用，是肝移植手術(shù)常用的麻醉性鎮(zhèn)痛藥，其主要通過細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450）系統(tǒng)在肝臟代謝。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诮⒋笫笱獫{中芬太尼濃度的測定方法，對芬太尼的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，比較其在大鼠無肝期前、后代謝過程的差異，為探討芬太尼是否存在肝外代謝途徑及其作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

芬太尼對照品（批號：171259-200601，純度：97.3%）、氨基比林對照品（批號：130351-200303，純度：94.6%）均由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水。

1.2 儀器

1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；QTRAP質(zhì)譜儀（美國AB公司）；高速離心機(jī)（美國Abbott公司）；Milli-Q plus型超純水器、微孔濾膜及過濾裝置（美國Millipore公司）；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF級大鼠20只，♂，12～14周齡，體質(zhì)量350～400 g，第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK（軍）-2002-009。

2 方法與結(jié)果

2.1 血樣采集

將大鼠分為正常對照組（A1）和無肝期組（A2），每組10只。乙醚麻醉大鼠，右股靜脈切開[1，2]，植入1.0號硅膠管，靜脈注射芬太尼20 μg·kg－1，A2組于注射前夾閉肝門。2組分別于注射后1、2、3、5、10、15、20、30、45、60、75、90 min時(shí)頸靜脈采血0.5 mL，同時(shí)回輸?shù)攘咳樗崃指褚骸８嗡乜鼓蛛x血漿，置于－70℃冷凍保存至測定。

2.2 檢測條件

2.2.1 色譜條件。色譜柱：Inertsil ODS-3（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸溶液（90∶10，V/V）；流速：0.2 mL·min－1；進(jìn)樣量：5 μL。

取空白血漿、空白血漿+芬太尼+氨基比林、樣品血漿進(jìn)樣測定，記錄色譜。結(jié)果表明，芬太尼、氨基比林與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)分離良好，具體色譜見圖1、圖2。

圖1 芬太尼高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+芬太尼+氨基比林；C.樣品血漿Fig 1 HPLC chromatograms of fentanylA.blank plasma；B.blank plasma+fentanyl+aminophenazone；C.plasma sample

2.2.2 質(zhì)譜條件。檢測方式：選擇性反應(yīng)監(jiān)測（SRM）；選擇離子對：m/z337.1/188.0（芬太尼）、m/z232.1/113.0（氨基比林）；氣簾氣：30.0 psi；離子源電壓：5 500 V；離子源溫度：350.0 ℃；去簇電壓（DP）：42.3 V/24.0 V；碰撞能（CE）：29.1 V/17.0 V。芬太尼和氨基比林的質(zhì)譜圖見圖3。

2.3 樣品處理

取0.2 mL血漿，加入內(nèi)標(biāo)液氨基比林（10 μg·mL－1）10 μL，旋渦混合30 s，加入0.2 mL的濃氨水（pH 13.0）振蕩混勻1 min，再加入正己烷1.2 mL，振蕩混勻1 min，3 500 r·min－1離心20 min，靜置10 min，然后取上清液1.0 mL于EP管中，室溫下氮?dú)獯蹈伞Ｏ虼蹈傻腅P管中加入100 μL甲醇，振蕩1 min，13 000 r·min－1離心5 min，取上清液20 μL進(jìn)樣分析。

圖2 氨基比林高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+芬太尼+氨基比林；C.樣品血漿Fig 2 HPLC chromatograms of aminophenazoneA.blank plasma；B.blank plasma+fentanyl+aminophenazone；C.plasma sample

圖3 質(zhì)譜圖A.芬太尼；B.氨基比林Fig 3 Mass chromatogramsA.fentanyl；B.aminophenazone

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白血漿加入芬太尼甲醇液（40 μg·mL－1）適量，使其濃度為400 ng·mL－1，再依次用空白血漿稀釋成200、100、50、20、10、5、2、1、0.5 ng·mL－1系列濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，記錄色譜。將芬太尼峰面積與氨基比林峰面積之比（R）對濃度（C）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：R＝0.015 6C+0.007 21（r＝0.999 7，n＝8）。結(jié)果表明，芬太尼檢測濃度的線性范圍為0.5～400 ng·mL－1，最低檢測濃度為0.2 ng·mL－1（以S/N≥3計(jì)）。

2.5 方法回收率與精密度試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下高、中、低（200、20、1 ng·mL－1）3種不同濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，每天測定5次，連續(xù)測定5 d，求得日內(nèi)和日間RSD及回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery and precision test

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下高、中、低（200、20、1 ng·mL－1）3種不同濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)品，分別按下述條件處理：－70℃低溫冰箱凍存7 d（1、3、7 d）、凍融次數(shù)（1、2、3次）、室溫放置2 h（1、2 h）、按“2.3”項(xiàng)下方法處理后室溫放置8 h（2、4、8 h），進(jìn)樣測定，結(jié)果芬太尼在上述條件下穩(wěn)定性良好，具體結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of stability test

2.7 血藥濃度與藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2組大鼠給藥后的平均藥-時(shí)曲線見圖4。

圖4 2組大鼠血漿中芬太尼的藥-時(shí)曲線（n＝10）Fig 4 Mean plasma concentration-time curves of fentanyl in rat plasma（n＝10）

由圖4可知，單次劑量注射芬太尼后，A2組較A1組大鼠血漿中芬太尼的血藥濃度明顯升高，AUC顯著性增大。采用DAS 2.1.1藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算得出2組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)顯示，A2組芬太尼終末半衰期（t1/2z）較A1組明顯延長，清除率（CL）明顯下降，AUC增加（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 各組大鼠血漿中芬太尼的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n＝10）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of fentanyl in rat plasma（n＝10）

4 討論

由于大鼠血漿中芬太尼的濃度較低，常規(guī)的高效液相色譜法無法滿足本實(shí)驗(yàn)的要求。本文參考文獻(xiàn)[3～6]建立了高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法，采用正己烷提取處理樣品，血樣量只需0.2 mL，操作簡便，每個(gè)樣品測定時(shí)間只需6 min，便于大規(guī)模樣品處理和分析，因此，該方法適用于大鼠體內(nèi)芬太尼血藥濃度的測定。

本實(shí)驗(yàn)以夾閉大鼠肝門模擬肝移植無肝期狀態(tài)，單次靜脈注射芬太尼后，觀察阻滯入肝血流后芬太尼血藥濃度變化情況。結(jié)果顯示，無肝期組血藥濃度衰減明顯比正常對照組減慢，清除率明顯下降，表明肝臟是芬太尼的主要代謝器官。但隨著無肝期時(shí)間的延長，芬太尼血藥濃度呈下降的趨勢，說明芬太尼可能也存在肝外代謝途徑，但其肝外代謝的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]顧健騰，陶國才，魯開智，等.大鼠腎臟異丙酚代謝相關(guān)ugt1a6基因在無肝期表達(dá)變化的研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（16）：1 697.

[2]顧健騰，陶國才.異丙酚的代謝酶及其肝外代謝概況[J].中國藥房，2007，18（10）：781.

[3]Huynh NH，Tyrefors N，Ekman L，et al.Determination of fentanyl in human plasma and fentanyl and norfentanyl in human urine using LC/MS/MS[J].J Pharm Biomed Anal，2005，37（5）：1 095.

[4]Chang YW，Yao HT，Chao YS，et al.Rapid and sensitive determination of fentanyl in dog plasma by on-line solid-phase extraction integrated with a hydrophilic column coupled to tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B，2007，857（2）：195.

[5]劉 維，段京莉，張現(xiàn)化，等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定全身麻醉患者血漿中舒芬太尼濃度[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2008，24（3）：245.

[6]李正翔，趙晴，董偉林，等.高效液相色譜法測定人血漿中芬太尼濃度[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24（10）：607.