HPLC 法測定甲狀旁腺激素（1-34）原料藥的含量

陳 秀，韓方璇，黃春新（海南省人民醫院藥學部，海口市 570102）

甲狀旁腺激素（1-34）（以下簡稱PTH（1-34））注射劑是由美國禮來公司開發用于治療骨質疏松癥的藥物，并于2002年在美國、丹麥和芬蘭等國上市（商品名為Forteo）[1]。PTH（1-34）用于治療具有高風險骨折性的絕經后骨質疏松癥，能增加骨密度并降低脊椎與非脊椎骨折的風險；同時也可以用于提高男性患有原發性骨質疏松癥或性腺功能減退的骨質疏松癥的骨量[2]。該藥治療對象包括具有骨質疏松引發骨折病史的患者，或有多種誘發骨折的風險及以往的針對骨質疏松癥治療方法對其失敗或無法耐受的患者[2～5]。國內已有文獻[6]報道PTH（1-34）的含量測定方法，該方法為高效液相色譜（HPLC）法，但存在一定缺陷：（1）分析時間較長，約40 min；（2）以0.1%的三氟乙酸（TFA）乙腈溶液為流動相，酸性較強，pH小于2，易損壞色譜柱；（3）采用梯度洗脫方法，對色譜柱要求較高，且基線不平，峰形不好。為了克服上述分析結果的缺點，筆者經多次篩選，在其基礎上進行改進，最后確定采用在水相中加入鹽、有機相采用甲醇為流動相及等度洗脫的HPLC法，用于測定PTH（1-34）原料藥的含量。結果表明，該方法的各項方法學研究各項指標均能達到要求。

1 儀器與試藥

UV-260紫外可見分光光度計（日本島津公司）；HP1100型HPLC儀、二極管陣列檢測器（美國惠普公司）。

PTH（1-34）對照品（美國 Peptide公司，批號：M 09245A1，經凱氏定氮法測定含量為99.8%）；PTH（1-34）原料藥（杭州諾泰制藥有限公司，批號：090601、090602、090603，經凱氏定氮法測定純度分別為98.7%、99.2%、99.6%）；硫酸鈉為分析純，甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Spherisorb ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為甲醇，流動相B為0.05 mol·L－1Na2SO4水溶液（磷酸調節至pH 2.5），A∶B＝30∶70，流速為1.0 mL·min－1；檢測波長為215 nm；柱溫為室溫；進樣量為20 μL。理論板數按PTH（1-34）峰計算應不低于2 000。

2.2 溶液的制備

供試品溶液：取本品適量加水溶解，稀釋至每1 mL中約含PTH（1-34）0.1 mg的溶液，即得。

對照品溶液：取經干燥至恒重的PTH（1-34）對照品適量加水溶解，制備成每1 mL中約含PTH（1-34）0.1 mg的溶液，即得。

2.3 波長的確定

利用紫外-可見分光光度計在190～760 nm波長范圍內掃描，結果表明PTH（1-34）在210、280 nm波長處均有吸收峰。通過二極管陣列檢測器在線掃描發現主要雜質峰在210、280 nm波長處均不明顯，但在215 nm波長處雜質峰和主峰都比較明顯，在藥品標準的建立時考慮到有關物質和主藥含量的同時測定，更有利于檢測的方便，故確定測定波長為215 nm。經驗證，在該波長下能夠達到含量測定的靈敏度要求。

2.4 流動相的確定

有機流動相的選擇：反相色譜常采用的有機流動相為甲醇和乙腈，甲醇的截止波長（205 nm）和乙腈的截止波長（190 nm）都小于測定波長，但考慮到甲醇價格低廉，所以選甲醇作為有機流動相[7]。

鹽種類的選擇：加入水相中的鹽筆者先后選擇了磷酸鈉、磷酸二氫鈉、氯化銨和醋酸鈉等緩沖鹽并調節緩沖鹽的濃度，改變水相與流動相的配比，結果PTH（1-34）的峰形和分離效果都不好。后來在水相中加入中性鹽硫酸鈉，并用磷酸調節pH值，結果峰形和分離效果得到了很大的改善。為了得到合適的保留時間、最好的峰形和分離效果，進行進一步試驗，試驗內容包括流動相的pH值以及水相與有機相的配比。試驗結果見表1。

表1 流動相的pH值、有機相與水相的配比篩選結果Tab 1 pH value of mobile phase and proportion screening of water phase and organic phase

從表1可以看出：流動相pH值在2.0時峰形較寬，基線不平，峰形拖尾；流動相pH值為2.5時基線平穩，峰形窄，沒有雜質峰；當流動相pH值3.0時峰形較寬，而且在3 min左右出現1個小的雜質峰，所以水相的pH值最后確定為2.5。

對于流動相比例，當有機相甲醇量為15%、水相量為85%時，主峰保留時間較長，為12.583 min，這樣不僅浪費時間，而且也浪費昂貴的試劑；而當甲醇量增加到35%、水相量減少到65%時，主峰保留時間太短，主峰理論板數達不到要求，也不利于雜質的分離。當甲醇量為30%、水相量為70%時，主峰保留時間適中，理論板數為8 612，故確定甲醇與水相比例為30∶70。

2.5 系統適用性試驗

取“2.2”項下制備的2種溶液適量，另取1份溶劑適量，均按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果表明供試品主峰與對照品主峰保留時間一致，另外空白溶劑對色譜條件的分離沒有明顯的影響，3種溶液的色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白溶劑；B.對照品；C.供試品；1.PTH（1-34）Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solvent；B.reference substance；C.test sample；1.PTH（1-34）

2.6 線性關系考察

制備不同濃度 PTH（1-34）溶液：0.06、0.10、0.20、0.40、0.90 mg·mL－1，按“2.10”項下方法測定，記錄圖譜，以進樣濃度（X）為橫坐標，PTH（1-34）峰面積積分值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。計算回歸方程得：Y＝1.323×105X－1.115×102（r＝0.999 97），表明PTH（1-34）檢測濃度的線性范圍為0.06～0.90 mg·mL－1。

2.7 進樣精密度試驗

取樣品適量，加水溶解，制備成0.1 mg·mL－1的溶液，精密吸取20 μL進樣，重復進樣6次，記錄色譜，測定峰面積。結果，峰面積RSD＝0.15%，表明精密度良好。

2.8 回收率試驗

分別稱取2 mg質量80%、100%、120%的PTH（1-34）原料藥，每種標示量各3份樣，按“2.2”項下供試品溶液制備方法分別加水溶解并稀釋至相應濃度，按含量測定方法，測定其回收率。結果平均回收率為98.6%（RSD＝0.38%），詳見表2。

表2 回收率試驗結果Tab 2 Results of recovery test

2.9 溶液穩定性試驗

取樣品適量，加水溶解，制備成濃度為0.1 mg·mL－1的溶液，分別于制備后第0、2、4、6、12 h進樣分析。結果，主峰面積積分值的RSD＝0.34%，表明本品溶液在12 h內穩定。

2.10 含量測定

取供試品適量，加水溶解，制備成濃度為0.1 mg·mL－1的溶液。精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜；另取經干燥至恒重的PTH（1-34）對照品適量，加水溶解，制備成濃度為0.1 mg·mL－1的溶液，同法測定，按外標法以峰面積計算，即得。

結果，3批樣品的標示含量分別為98.1%、98.9%和99.2%，均在95.0%～105.0%之間，符合原料藥質量標準要求，說明該色譜分析測定法可控性好。

3 討論

本試驗考察了流動相pH值和流動相配比對基線、峰形和理論板數的影響，結果表明，流動相的pH值為2.5、有機相為30%、水相量為70%時，峰形較好，保留時間適中，主峰理論板數達到要求，表明該方法可行。

綜上所述，本方法簡便、準確、靈敏度高，可用于甲狀旁腺激素（1-34）原料藥含量的測定。

[1]韋 佳.甲狀旁腺激素激動劑特立帕肽[J].藥學進展，2004，28（10）：476.

[2]張 穎，彭永德.骨質疏松治療新藥特立帕肽[J].世界臨床藥物，2004，25（12）：725.

[3]孟 萍.甲狀旁腺激素促進骨形成的研究進展[J].中國臨床康復，2004，8（3）：540.

[4]韓志巖，彭錦軒.甲狀旁腺激素治療骨質疏松研究進展[J].中國藥理學通報，1997，13（5）：395.

[5]宋彥玉，彭錦軒.甲狀旁腺激素及其受體的藥理學研究[J].中國藥理學通報，1997，13（6）：481.

[6]梁成罡，李克堅，張 慧，等.重組人甲狀旁腺激素的質量研究[J].藥物分析雜志，2005，25（2）：215.

[7]李發美.分析化學[M].北京：人民衛生出版社，2007：398.