8種頭孢類抗菌藥物無菌檢查的方法學驗證研究

王偉萍，李海芳，朱毅忠，曹艷玲（新疆維吾爾自治區食品藥品檢驗所，烏魯木齊 830004）

頭孢類抗生素是β-內酰胺類抗生素中的一種，抗菌活性強，已成為臨床抗感染治療的主要藥物，用量已占抗感染藥物總用量的20%，并有繼續增長趨勢。建立該類抗生素注射用滅菌粉末的無菌檢查方法，必須首先有效地消除其抑菌作用，才有可能檢出制劑中污染的微生物，避免假陰性結果的發生。本試驗采用薄膜過濾法，以不同沖洗量并且加入不同濃度的β-內酰胺酶以消除殘留抗生素的抑菌活性，以期建立8種頭孢類抗生素注射用滅菌粉末無菌檢查方法并進行驗證，同時對試驗中應注意的問題進行了討論。

1 材料

1.1 儀器

HTY-2000A型集菌儀、一次性全封閉集菌培養器（杭州高得醫療器械有限公司）；檢驗全過程在潔凈度為100級的單向流空氣區域內進行，其環境潔凈度為10 000級，嚴格遵守無菌操作，同時做環境的動態測定。

1.2 培養基

硫乙醇酸鹽液體培養基（批號：0211072）、0.1%蛋白胨水溶液（批號：060302）、青霉素酶（批號：20070320，規格：2 mL，純度：＞300萬u·mL－1）均購于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 菌株

大腸埃希菌（Escherichia coli，批號：CMCC（B）44102）、金黃色 葡萄球 菌（Staphylococcus aureus，批號 ：CMCC（B）26003）、銅綠假單胞菌（Pseudomdnas aeruginosa，批號：CMCC（B）10104）、白色念珠菌（Candida albicans，批號：CMCC（F）98001）均購于中國藥品生物制品檢定所，制備成含菌數為10～100 cfu·mL－1的稀釋液。

1.4 試藥

（1）注射用頭孢拉定（蘇州益良藥業有限公司，批號：20050501，規格：每支2.0 g）；（2）注射用頭孢呋辛鈉（浙江亞太藥業股份有限公司，批號：060601，規格：每支1.5 g）；（3）注射用頭孢曲松鈉（石藥集團中諾藥業（石家莊）有限公司，批號：04108318，規格：每支1.0 g）；（4）注射用頭孢哌酮鈉（哈藥集團制藥總廠，批號：20041202，規格：每支1.0 g）；（5）注射用頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉（浙江亞太藥業股份有限公司，批號：060801，規格：每支2.0 g）；（6）注射用頭孢他啶（海南海靈制藥廠有限公司，批號：0602091，規格：每支1.0 g）；（7）注射用頭孢唑啉鈉（石藥集團中諾藥業（石家莊）有限公司，批號：06048009，規格：每支0.5 g）；（8）注射用頭孢噻肟鈉（樂山三九長征藥業股份有限公司，批號：041101，規格：每支1.0 g）。

2 方法[1]

2.1 菌液與供試品的制備

分別取經37℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌肉湯培養物10倍稀釋為10～100 cfu·mL－1，備用；取經25℃培養18～24 h的白色念珠菌霉菌液體培養物用標準比濁管比濁，10倍稀釋為10～100 cfu·mL－1，備用。

2.1.1 試驗組：每種樣品各取10支，以無菌操作將其溶解于250～500 mL的0.1%無菌蛋白胨水溶液中，并稀釋至藥液濃度約為20 mg·mL－1，作為供試液備檢；取三聯無菌檢查用濾器，先用沖洗液（無菌0.1%蛋白胨水溶液）潤濕濾膜，取250 mL供試液過濾，濾干后用沖洗液沖洗，每次沖洗100 mL，沖洗3～5次，濾干后分別灌注規定量的培養基，每筒分別加入150萬u·100 mL－1或300萬u·100 mL－1的青霉素酶，在陽性對照管中加入10～100 cfu的陽性菌懸液1 mL，按規定培養，逐日觀察結果。

2.1.2 試驗菌陽性對照組：不加樣品及青霉素酶，只加陽性菌，其他操作同“2.1.1”項。

2.1.3 樣品組：加樣品及陽性菌，不加青霉素酶，其他操作同“2.1.1”項，該樣品組具有抑菌作用。

2.1.4 陰性對照組：以稀釋液替代樣品液，沖洗液及沖洗量同“2.1.1”項，薄膜過濾后加入相同量的培養基。

表1 8種樣品試驗情況Tab 1 The growth state of 8 kinds of samples

圖1 注射用頭孢呋辛鈉樣品的金黃色葡萄球菌培養結果（每筒加入青霉素酶300萬u、沖洗量300 mL）Fig 1 The growth state of Staphylococcus aureus in cefuroxime sodium for injection（300 mL fluid and 3 000 000 u of panicillinase）

圖2 注射用頭孢唑啉鈉樣品的金黃色葡萄球菌培養結果（每筒加入青霉素酶300萬u、沖洗量300 mL）Fig 2 The growth state of Staphylococcus aureus in cefazolin sodium for injection（300 mL fluid and 3 000 000 u of panicillinase）

2.2 青霉素酶的加入量

在濃度為1∶100 mL的培養基中加入300萬u青霉素酶，即1 mL青霉素酶原液；在濃度2∶100 mL的培養基中加入150萬u青霉素酶，即0.5 mL青霉素酶原液。以3 d內濾器中培養基是否長菌為試驗指標，觀察不同濃度的青霉素酶液對各樣品抑菌活性的消除效果。

2.3 沖洗次數

以2種不同的沖洗次數進行試驗：（1）每次沖洗100 mL，沖洗3次；（2）每次沖洗100 mL，沖洗5次。觀察沖洗次數對樣品抑菌活性的影響。

3 結果

3.1 不同沖洗量對消除抑菌活性的影響

8種樣品試驗情況見表1（均為培養1～3 d后的觀察結果，其中“＋”表示有菌生長，“－”表示無菌生長。

由表1可見，上述8種樣品，在沖洗量為每筒500 mL、加酶量為每筒300萬u的條件下，試驗菌均在2 d內生長良好。但不同品種在培養相同時間內菌株的生長情況不同，如注射用頭孢呋辛鈉和注射用頭孢唑啉鈉在培養24 h后，注射用頭孢呋辛鈉樣品的金黃色葡萄球菌（每筒300萬u青霉素酶，沖洗量300 mL）生長良好，優于注射用頭孢唑啉鈉樣品的金黃色葡萄球菌，照片見圖1、圖2。

另外，注射用頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉最敏感菌為大腸埃希菌，其余樣品最敏感細菌為金黃色葡萄球菌。

3.2 相同沖洗量對消除抑菌活性的影響

在相同沖洗量下，不同加酶量對樣品的抑菌活性的消除力不同，如注射用頭孢他啶在500 mL的沖洗量下，加入300萬u青霉素酶的大腸埃希菌株生長良好（培養48 h后），加入150萬u青霉素酶的大腸埃希菌株未生長（培養48 h后），照片見圖3。

4 討論

無菌檢查沖洗量過大，會造成濾膜損傷以及影響細菌細胞的滲透壓，造成菌體死亡[2]。本方法采用酶抑制法消除抗菌作用，沖洗量控制在每筒500 mL，為既對濾膜損傷小又能有效清除抗生素殘留的最佳沖洗量。同時，對于對β-內酰胺酶不穩定的抗生素，可在硫乙醇酸鹽流體培養基中加β-內酰胺酶共同培養，此方法能使敏感菌在沖洗量較小時即良好生長。

本次試驗中第2代的頭孢呋辛鈉對應的敏感菌為大腸埃希菌，第3代的頭孢哌酮鈉和頭孢曲松鈉對應的敏感菌為金黃色葡萄球菌。這可能是因為本次試驗是先固定沖洗量再調整加酶量，與先固定加酶量再調整沖洗量所得出的敏感菌結果有所不同。加酶的順序不同，其對菌體的作用機制可能不同，尚有待進一步研究。

為節省酶的用量，本次試驗對加酶量進行了摸索。結果表明，注射用頭孢拉定、注射用頭孢呋辛鈉、注射用頭孢哌酮鈉、注射用頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉、注射用頭孢他啶、注射用頭孢唑啉鈉、注射用頭孢噻肟鈉均需加酶每筒300萬u，并且沖洗量需每筒300 mL；而注射用頭孢曲松鈉在加酶量每筒150萬u、沖洗量每筒500 mL的條件下，陽性菌即可生長。

試驗中應注意進行動態測定，記錄動態結果，以保證試驗環境的安全可靠。試驗操作細節方面，根據筆者的試驗體會，蕩洗這一步非常必要，但操作時難免會沾濕濾筒上部通氣孔上的膜。該膜沾濕后通透性會改變，將不能有效阻擋細菌，可能會影響試驗結果，故建議將濾筒上部的小膜改為與下部濾膜相同的材質，建議中國藥品檢驗標準操作規范（SOP）上可規定：“樣品溶液快速濾過后，用沖洗液分次沖洗。每次加入50 mL（或100 mL）沖洗液，振搖蕩洗濾筒后濾過。”

圖3 注射用頭孢他啶樣品的大腸埃希菌培養結果A.每筒加入青霉素酶150萬u、沖洗量500 mL；B.每筒加入青霉素酶300萬u、沖洗量500 mLFig 3 The growth state of Escherichia coli in Ceftazidimefor injectionA.1 500 000 u of panicillinase，500 mL fluid；B.3 000 000 u of panicillinase，500 mL fluid

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：附錄ⅪH.

[2]張曉明，杜海娟，何曉英，等.抗菌素粉針劑無菌檢查的最佳沖洗量及沖洗方法的實驗研究[J].中國藥品標準，2004，5（1）：56.