HPLC法測定羅紅霉素分散片含量的測量不確定度分析

左登平，何亞瓊，汪正宇(.安徽宿州市藥品檢驗所，宿州市34000；.安徽宿州衛生學校，宿州市34000)

測量不確定度是指“表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結果相關聯的參數”，它是指測量客觀值在某一量值范圍內的一個評定，不確定度越小，測量結果的質量越高，使用價值越大[1]。羅紅霉素是一種抗菌譜與紅霉素相似，不良反應低于紅霉素的大環內酯類抗生素，其含量測定結果的準確性是評定藥品質量的重要指標。本文根據2010年版《中國藥典》(二部)質量標準[2]，并參考有關文獻[3，4]，應用高效液相色譜法(HPLC)對羅紅霉素分散片進行含量測定的測量不確定度進行分析，以期找出影響不確定度的因素來進行評估，為該藥品的評價檢測報告提供科學依據。

1 儀器與試藥

LC-10Atvp型高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-10Atvp型紫外檢測器；電子天平(型號:AB 135-S，d＝0.01 mg)。

羅紅霉素對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號:130557-200502，純度:94.1%)；羅紅霉素分散片(江蘇恒瑞股份有限公司，批號:09121951，規格:0.15 g)；乙腈為色譜純，水為純化水，其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件與系統適用性

色譜柱:Phenomenex ODS C18(4.6 mm×150 mm、5μm)；流動相:水-乙腈-冰醋酸(65∶35∶1)；檢測波長:210 nm；流速:1.0 mL·min－1；進樣量:20μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取羅紅霉素對照品適量(對照品1為24.40 mg，對照品2為24.30 mg)，置25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取細粉適量(A樣97.60 mg，B樣93.50 mg)，置于50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 樣品測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測定，按外標法(峰面積)計算含羅紅霉素96.8%。

2.5 測量數學模型

根據測定原理和過程，含量計算公式為:

其中，Y:羅紅霉素分散片標示量的百分含量；A樣:供試品峰面積；A對:對照品峰面積；W對:對照品重量(mg)；W樣:供試品重量(mg)；W:供試品平均片重(mg)；f對:對照品稀釋倍數(mL)；f樣:供試品稀釋倍數(mL)；標示量為0.15 g。導出方差:

3 不確定度分析

3.1 測量和分析不確定來源

3.1.1 玻璃儀器引起的相對標準不確定度:(1)校準。試驗中所用玻璃儀器有:A級25 mL、50 mL量瓶，由文獻[5]得容量允差分別為±0.03 mL、±0.05 mL。由于標定值比極限值出現的可能性更高，按三角分布，由允差引起的標準不確定度分別為:u(25)＝0.03＝1.22×10－2mL、u(50)＝0.05/＝2.04×10－2。(2)溫度。量瓶和溶液的溫度與校正時溫度不同和實驗室溫度變化而引起的體積不確定度。由于供試品溶液和對照品溶液是在相同條件下配制，溫差和溶劑的膨脹系數相同，故溫度引起的偏差被抵消。玻璃儀器引起的相對標準不確定度為:urel(25)＝u(25)/25＝4.90×10－4、urel(50)＝u(50)/50＝4.08×10－4。

3.1.2 對照品稱量的相對標準不確定度ure(lW對):(1)天平稱量重復性不確定度。所用電子天平(d＝0.01 mg)的鑒定證書給出的重復性誤差為±0.02 mg，按矩形分布:W對－01＝0.02/＝2.08×10－2。(2)天平示值不確定度。所用電子天平的鑒定證書給出的最大允差為±0.1 mg，按矩形分布:W對－02＝0.1/＝6.93×10－2mg試驗平行稱取對照品2份，每份對照品稱量的相對標準不確定度分別為:對照品1的ure(lW對a)＝，對照品2的urel(W對b)＝。所以，對照品稱量的相對標準不確定度為:10－3。

3.1.3 對照品峰面積的相對標準不確定度urel(A對):(1)對照品溶液1測量5次，峰面積分別為1707730.6、1699434.0、1716899.2、1708867.0、1710052.1，平均峰面積A對1＝1708596.6，標準偏差SD＝6241.55urel(A對1)＝SD/A對1＝6241.55/1708596.6＝3.65×10－4。(2)對照品溶液2測量5次，峰面積為:1711445.0、1711940.4、1687465.6、1697386.5、1709847.5，平均峰面積A對2＝1703617.0，標準偏差SD＝10828.9同上可得:urel(A對2)＝SD/A對2＝10828.9/1703617.0＝6.36×10－3對照品溶液色譜峰面積引起的相對標準不確定度:

3.1.4 對照品稀釋引起的相對標準不確定度urel(f對):對照品配置過程中使用2個A級25 mL量瓶。由配置引起的相對標準不確定度為:

3.1.5 對照品純度的相對標準不確定度ure(lS):對照品純度的標準不確定度u(S)屬B類不確定度。羅紅霉素對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，純度為94.1%。由于目前沒有給出不確定度的其他說明，故暫假定其分散區間的半寬度a＝0.25%[6]，按均勻分布換算:u(S)＝0.25%/＝0.14%，其相對標準不確定度為

3.1.6 供試品稱量的相對標準不確定度ure(lW樣):(1)天平稱量重復性不確定度。同“2.6.2(1)”項，W樣－01＝0.02/＝2.08×10－2。(2)天平示值不確定度。同“2.6.2(1)”項，W樣－02＝0.1/＝6.93×10－2。試驗平行稱取供試品2份，每份供試品稱量的相對標準不確定度分別為:供試品A樣的ure(lW樣a)＝；供試品B樣的urel(W樣b)＝所以，供試品稱量的相對標準不確定度為:10－3。

3.1.7 平均片重的相對標準不確定度urel():(1)天平稱量重復性不確定度。同2.6.2中(1)項，u(1)＝2.08×10－2。(2)天平示值不確定度。同2.6.2中(2)項:u(2)＝0.1=6.93×10－2，裝量差異實驗過程中，共使用天平20次，=282.1 mg。所以，裝量差異稱量的相對標準不確定度為:urel()＝

3.1.8 供試品峰面積的相對標準不確定度urel(A樣):(1)供試品溶液1測量峰面積5次:1866879.6、1870842.6、1869542.6、1870547.2、1866493.5，平均峰面積A樣1＝1868861.1，標準偏差SD＝2047.29，相對標準不確定度:urel(A樣1)＝SD/A樣1＝2047.29/1868861.1＝1.10×10－3。(2)供試品溶液2測量峰面積5次:1793703.4、1792799.8、1801896.3、1792561.2、1785297.3，平均峰面積A樣2＝1793251.6，標準偏差SD＝5892.51，相對標準不確定度:urel(A樣2)＝SD/A樣2＝5892.51/1793251.6＝7.33×10－4；供試品溶液色譜峰面積引起的相對標準不確定度為

3.1.9 供試品稀釋引起的相對標準不確定度urel(f樣):供試品配置過程中使用2個A級50 mL量瓶。由配置引起的相對標準不確定度為

3.2 計算合成相對標準不確定度的uC(Y)

3.3 計算擴展不確定度u(Y)

取包含因子k＝2(近試95%的置信概率)[7]，擴展不確定度為:u(Y)＝2uC(Y)＝1.6%。

3.4 不確定度測量報告及各分量所占比例

HPLC測定羅紅霉素分散片含量的測量結果可表示為:(96.8±1.6)%，各相對標準不確定度所占比例見表1。

表1 各相對標準不確定度所占比例Tab 1The precentage of the relative standard uncertainty

4 討論

由表1可見，在引起羅紅霉素分散片含量測定的不確定來源各分量中，對照品的峰面積、對照品稱量和供試品峰面積引起的不確定度分量所占比重較大。這主要是由于對照品和供試品稱量及儀器本身不穩定等因素引起的。因此，在以后的試驗中，可以通過增加測定次數和對照品的取樣量等措施來減少不確定度。另外，對照品和供試品稀釋倍數引起的不確定度分量所占比重相對較小。這可能與實驗室加強對玻璃儀器的保養，使其保持穩定的狀態有關，同時要求在實驗中要加強實驗過程的控制以及加強基本操作、標準操作訓練，以減少隨機變化和人為因素對試驗結果影響。

本分析得出的擴展不確定度為1.6%，表明結果較為準確可靠，本方法可用于測定羅紅霉素分散片含量的測量不確定度分析。

[1]國家藥典委員會編.國家藥品標準[S].WS-127(X-103)-2005(1).

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(二部)[S].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社，2010:1.

[3]中國實驗室國家認可委員會編.化學分析中不確定度的評估指南[M].北京:中國計量出版社，2002:1.

[4]魏吳.化學分析中不確定度的評估指南[M].北京:中國計量出版社，2002:11.

[5]國家質量技術監督局.常用玻璃量器檢定規程[S].JJG196-2006.

[6]黃諾嘉，楊文紅，黃奕濱.HPLC法測定蘆薈膠囊中蘆薈苷含量的不確定度評定[J].中國藥師，2009，12(9):1318.

[7]王玉，姚克榮.HPLC法測定非那雄胺片含量及含量均勻度的不確定度分析[J].藥物分析雜志，2005，25(10):1244.