廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌的分離鑒定

何麗麗,李春玲,王貴平,賈愛卿,楊冬霞,宣春玲,鄭鐵鎖,王金生

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510640;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

副豬嗜血桿菌病又稱豬格氏病,主要引起豬的纖維素性多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎,甚至腦炎,其病原為副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,Hps)。此病過去一直被認(rèn)為是仔豬的一種散發(fā)性、應(yīng)激性疾病。但是近年來,隨著養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展,越來越多的高健康豬群或SPF豬群的出現(xiàn),這些豬如果處于一種未免疫狀態(tài),一旦Hps入侵,就會(huì)受到嚴(yán)重感染,甚至死亡。各種日齡的豬均可感染[1]。Turni C等[2]研究表明副豬嗜血桿菌病的發(fā)病率可達(dá)50%～70%,死亡率可達(dá)10%以上。近年來,美國、日本、加拿大、德國、澳大利亞、丹麥、西班牙等養(yǎng)豬業(yè)較發(fā)達(dá)的國家均已對(duì)本國的副豬嗜血桿菌病的流行情況進(jìn)行了調(diào)查,結(jié)果顯示副豬嗜血桿菌從臨床發(fā)病豬中的分離率可達(dá)20%,而且流行的副豬嗜血桿菌血清型通常為毒力較強(qiáng)的血清型,如血清5型、4型和13型等[3],這些血清型在我國絕大多數(shù)豬場(chǎng)也存在和流行。目前,副豬嗜血桿菌已成為影響世界畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要致病菌,受到越來越多的關(guān)注。在我國,近年來由副豬嗜血桿菌引起豬的漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報(bào)道越來越多,此病給養(yǎng)豬業(yè)帶來了慘重的經(jīng)濟(jì)損失。為了解廣東地區(qū)豬場(chǎng)中副豬嗜血桿菌的感染狀況,課題組對(duì)廣東省部分豬場(chǎng)送檢病料進(jìn)行了副豬嗜血桿菌分離和鑒定,將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品 2007年9月～2008年9月,從廣東地區(qū)37個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)送檢病豬中采集病料372份,采集部位包括心、心血、肺 、肝、脾 、腎、腦、扁桃體 、淋巴結(jié)、心包積液、關(guān)節(jié)液。

1.2 主要試劑 10×Buffer、dNTPs、Taq酶購自TaKaRa公司;TSA、TSB培養(yǎng)基購自O(shè)xioid公司;微量生化管、藥敏紙片均購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌分離 無菌取病變組織,分別接種于TSA、TSB培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)16～18 h。

1.4 涂片鏡檢 挑取平板上典型的單個(gè)菌落涂片,革蘭染色后在油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,序列分別為:

上游 :5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′

下游 :5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′

預(yù)期擴(kuò)增片段大小為822 bp。

1.6 生化鑒定 采用微量生化管法,取單菌落純培養(yǎng)后分別接種于果糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、木糖、L-阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、吲哚、脲酶、蔗糖等微型生化鑒定管[4],接種前先在生化管里加入V因子,同時(shí)做觸酶試驗(yàn)。

1.7 耐藥性檢測(cè) 根據(jù)2000年美國NCCLS所建議的藥敏試驗(yàn)藥物選擇規(guī)則選取藥敏紙片,用無菌鑷子夾無菌棉花蘸取副豬嗜血桿菌TSB培養(yǎng)物,涂布接種于TSA平板上,待稍干后,用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼于培養(yǎng)基表面,37℃培養(yǎng)20～24 h后,測(cè)量抑菌圈直徑,根據(jù)美國NCCLS細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)處理 統(tǒng)計(jì)副豬嗜血桿菌分離率、豬場(chǎng)陽性感染率及不同時(shí)間、不同地區(qū)的分離率等。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離與鑒定 分離菌為革蘭陰性,具多形性,從短桿狀到細(xì)絲狀;TSA固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16～24 h后,菌落透明、光滑濕潤(rùn),具有藍(lán)色熒光,見圖1。PCR鑒定結(jié)果見圖2。

圖1 Hps在TSA平板上的菌落形態(tài)

2.2 副豬嗜血桿菌的分離結(jié)果 2007年9月～2008年9月,共檢測(cè)病料372份,PCR擴(kuò)增副豬嗜血桿菌陽性52份,但只有39份病料中分離到副豬嗜血桿菌,實(shí)際分離率(10.48%)要低于PCR檢出率(13.98%);來源于廣東地區(qū)37個(gè)豬場(chǎng)的125頭發(fā)病豬中,從30頭病豬都分離到副豬嗜血桿菌,分離率可達(dá)24.00%。

圖2 Hps分離株16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1 不同時(shí)間副豬嗜血桿菌的檢出情況 副豬嗜血桿菌病在2007年12月～2008年2月發(fā)病率較高,而3～9月發(fā)病率相對(duì)較低,此病發(fā)生可能與氣候有關(guān),該病于秋、冬季發(fā)病率要高于春、夏季,見表1。

表1 不同時(shí)間副豬嗜血桿菌的檢出情況

2.2.2 廣東省不同地區(qū)副豬嗜血桿菌檢出情況從37個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)中,共檢測(cè)出副豬嗜血桿菌陽性豬場(chǎng)15個(gè),豬場(chǎng)平均陽性率達(dá)40.54%,說明副豬嗜血桿菌病在廣東地區(qū)已普遍流行;而且以粵東地區(qū)最高,這可能與這些地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)比較發(fā)達(dá)、豬場(chǎng)規(guī)模化和集約化程度高有關(guān),見表2。

表2 廣東省不同地區(qū)副豬嗜血桿菌檢出情況

2.3 副豬嗜血桿菌分離株生化鑒定 多數(shù)副豬嗜血桿菌分離株只發(fā)酵果糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖,觸酶陽性,不發(fā)酵棉籽糖和吲哚等,見表3。

2.4 副豬嗜血桿菌分離株藥敏試驗(yàn) 23株副豬嗜血桿菌分離株對(duì)頭孢氨噻肟、頭孢曲松鈉、阿奇霉素、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、左氟沙星等抗生素敏感;對(duì)阿莫西林、先鋒霉素Ⅴ中度敏感;而對(duì)復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、丙氟哌酸、恩諾沙星等耐藥,見表4。

3 討論

副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道(鼻腔、扁桃體和氣管前段等)的常在菌,但是在不利的飼養(yǎng)環(huán)境下,它能夠侵入宿主其他器官,引起豬的格氏病,屬于一種條件性致病菌[5]。副豬嗜血桿菌病通常引起豬的漿液纖維素性甚至膿性纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦炎、敗血癥伴隨卡他性支氣管肺炎,臨床癥狀包括高燒(41.5℃)、咳嗽、腹式呼吸、關(guān)節(jié)腫脹和一些中樞神經(jīng)癥狀,如側(cè)臥、震顫[6],影響豬的生長(zhǎng),也能導(dǎo)致豬的突然死亡。本研究所調(diào)查的副豬嗜血桿菌發(fā)病豬場(chǎng),主要表現(xiàn)為豬的關(guān)節(jié)腫脹、咳嗽、全身發(fā)紅,剖檢觀察,可以發(fā)現(xiàn)大多數(shù)病豬心包積液、胸腔積液、心臟表面包裹一層纖維素性滲出物、血凝不良、肺間質(zhì)增寬;或者肺臟肉樣變、肺與心包粘連、扁桃體充血、關(guān)節(jié)有漿液性或者膿性滲出物,部分病豬腦部充血、水腫積液。

表3 部分副豬嗜血桿菌分離株生化鑒定結(jié)果

表4 23株副豬嗜血桿菌分離株耐藥情況

從2007年9月～2008年 9月,共檢測(cè) 125頭患病豬,從其中的30頭病豬體內(nèi)分離到副豬嗜血桿菌,分離率達(dá)24.00%;從372份病料中的39份病料分離到副豬嗜血桿菌(不包括扁桃體、鼻拭子),病料分離率達(dá)10.48%,豬場(chǎng)平均陽性率達(dá)40.54%,與國內(nèi)外報(bào)道相似[7]。而且副豬嗜血桿菌陽性豬場(chǎng)都不同程度的伴有繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒的感染。

副豬嗜血桿菌是V因子依賴菌,對(duì)生長(zhǎng)條件要求比較苛刻,分離比較困難,作者通過分離發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌從心臟、肺臟的分離率高于從心包積液、關(guān)節(jié)液的分離率,病料超過12 h或使用過比較多的抗生素治療的病豬,副豬嗜血桿菌的分離率就會(huì)更低。副豬嗜血桿菌在培養(yǎng)過程中很容易污染,保存時(shí)間短,因此要注意進(jìn)行副豬嗜血桿菌的純化與鑒定。

副豬嗜血桿菌病在規(guī)模化的豬場(chǎng)暴發(fā)的頻率越來越高,但到目前為止,副豬嗜血桿菌的毒力因子、副豬嗜血桿菌病的發(fā)病機(jī)理等尚不清楚。而HPS的血清型眾多,血清型之間缺乏有效的交叉保護(hù),副豬嗜血桿菌又具有明顯的地方特征,因此,開展不同地區(qū)副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)調(diào)查,了解其流行的主要血清型,以研制出適合當(dāng)?shù)厥褂玫囊呙?對(duì)于有效的控制和預(yù)防該病至關(guān)重要[8-9]。

[1]Peter Kielstein,Vicki J Rapp-Gabrielson.Designation of 15 Serovars of Haemophilus parasuis on the Basis of Immunodiffusion Using Heat-Stable Antigen Extractst[J].American Society for Microbiology,1992,30(4):862-865.

[2]T urni C,Blackall P J.Comparison of sampling sites and detection methods for Haemophilus parasuis[J].Australian Veterinary Journal Volum,2007(5):177-184.

[3]Maclnnes J I,Desrosiers R.Agents of the “Suis-ide Diseases”of Swine:Actinobacillus suis,Haemophilus parasuis,and Streptococcus suis[J].Can J Vet Res,1999,63:83-89.

[4]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:125.

[5]瞿曉蘭,陳小玲.副豬嗜血桿菌病[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(3):99-101.

[6]Marta Cerda-Cuellar,Virginia Aragon.Serum-resistance in Haemophilus parasuis is associated with systemic disease in swine[J].T he Veterinary Journal,2008,175:384-389.

[7]尹秀鳳,王艷,姜平,等.副豬嗜血桿菌PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,27(2):180-183.

[8]華升,梅書棋,曾德芳.副豬嗜血桿菌病研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(11):7-10.

[9]冼瓊珍,黃耿森,王淑敏,等.副豬嗜血桿菌的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2006,42(3):27-28.