鴨疫里默氏菌3種不同佐劑滅活疫苗免疫效果比較

林麗超,陳建紅,黃得純,張濟培,司興奎

(佛山科學技術學院生命科學學院,廣東佛山528231)

鴨疫里默氏菌病是侵害雛鴨、雛鵝及雛火雞等多種禽類的一種急性或慢性敗血性傳染病,其病變特征為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎。本病在我國許多省區均有發生,已成為危害養鴨業最嚴重的細菌性傳染病。目前,藥物預防雖有一定效果,但由于細菌耐藥性的不斷增強,使純粹依賴藥物防治有一定難度;研制安全、有效的疫苗是控制鴨疫里默氏菌病的另一有效途徑。本研究擬對雛鴨接種不同佐劑及不同保存時間的鴨疫里默氏菌滅活疫苗,并經攻毒作免疫保護比較,以探討鴨疫里默氏菌滅活疫苗的有效佐劑及有效保存時間,為提高本病的免疫效果提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和試驗動物 鴨疫里默氏菌菌株來源于廣東三水,由佛山科學技術學院畜牧獸醫研究所提供。試驗動物為1日齡健康仙湖肉鴨,由佛山科學技術學院科研禽場提供。

1.2 疫苗制備 將鴨疫里默氏菌(RA)菌種接種于血液瓊脂平板培養基,于37℃燭缸中培養24h,選擇單個菌落。將RA純培養物接種于血清營養肉湯中于37℃恒溫增菌培養24h,作RA疫苗基礎菌液。加入0.3%甲醛,37℃滅活24h。

每月定期用3種佐劑制備RA滅活疫苗：(1)將RA滅活菌液與一定比例吐溫-80混合后制成水相,再與一定比例白油乳化成油乳劑滅活疫苗。(2)將RA滅活菌液按適當比例加入蜂膠提取液(蜂膠10mg/mL),充分混勻成蜂膠滅活疫苗。(3)將RA滅活菌液與鋁膠佐劑按一定比例混勻成RA鋁膠滅活疫苗[1-2]。

1.3 滅活疫苗安全性試驗 滅活疫苗接種于血液瓊脂平板培養基,48h后觀察,無細菌生長為合格。15只7日齡健康仙湖肉鴨,隨機均分3組,1組胸部皮下注射RA油乳劑滅活疫苗2mL/只,2組胸部皮下注射RA蜂膠滅活疫苗2mL/只,3組胸部皮下注射RA鋁膠滅活疫苗2mL/只,連續觀察10d。

1.4 滅活疫苗保存期試驗

1.4.1 保存處理 將先后制備的RA油乳劑滅活疫苗、蜂膠滅活疫苗、鋁膠滅活疫苗分別分裝,在4℃冰箱保存。抽取保存 90、150、180、210、240、270d的各種滅活疫苗各1瓶進行試驗。

1.4.2 動物分組和免疫攻毒試驗 將140只1日齡健康鴨隨機分成20組,每組7只。1～18組鴨在7日齡按表1經胸部皮下注射不同疫苗作首免(0.4mL/只),14日齡作 2免(0.6mL/只)。19組為非免疫攻毒對照組,20組為健康對照組,不作免疫接種。21日齡對1～19組鴨用同源菌株菌液(菌液活菌數約為1.8×108CFU/mL)通過足墊部注射進行攻毒;注射劑量0.5mL/只。第20組不攻毒作健康對照。攻毒后連續觀察10d,統計存活率,并對死亡鴨和存活鴨剖檢其病變,對可疑者作細菌分離鑒定。

表1 試驗分組與處理

2 結果與分析

2.1 滅活疫苗安全性檢驗結果 接種3種滅活疫苗后,雛鴨1d內出現精神委頓,食欲下降,1d后精神、食欲恢復正常,試驗結束未發現死亡病例,剖檢雛鴨無肉眼可見的病變,表明 3種滅活疫苗均具有良好的安全性。但油乳劑滅活疫苗組鴨,注射部位的肌肉可見一綠豆大小的硬塊。蜂膠和鋁膠滅活疫苗組鴨注射部位未見紅腫與異物。

2.2 RA滅活疫苗免疫保護試驗結果 從表2可見,油乳劑滅活疫苗隨保存時間的延長,免疫保護率保持穩定有逐漸上升的趨勢,蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗隨保存時間的延長,免疫保護率有逐漸下降的趨勢。

同一保存時間不同佐劑疫苗比較,油乳劑滅活疫苗免疫保護率同比均優于蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗。相同佐劑疫苗不同保存時間比較,油乳劑滅活疫苗免疫保護率比較穩定,從90d到270d保存期疫苗免疫保護率維持在71.4%～100%之間,同比優于蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗,保存270d的RA油乳劑滅活疫苗免疫保護率仍可維持在100%。不同保存期的蜂膠滅活疫苗,免疫保護率波動于42.9%～71.4%之間。鋁膠滅活疫苗的免疫效果基本與保存時間成反比關系,保存90d的疫苗免疫保護率為71.4%,保存240d的疫苗免疫保護率為33.3%,例外的是保存到270d的疫苗免疫保護率反而有所上升,為57.1%。

表2 3種不同佐劑不同保存時間免疫保護試驗結果

2.3 攻毒后剖檢結果 對攻毒死亡鴨剖檢可見,多數病死鴨發生纖維素性心包炎,心包積液,嚴重者心包膜與胸腔內膜粘連;肝周炎,表面被裹淡黃色的纖維素性滲出物;其病變特征與鴨疫里默氏菌病典型病變相符。

3 討論

3.1 不同佐劑RA滅活疫苗免疫效果的比較 油佐劑是目前動物滅活疫苗中應用最為廣泛、效果較為可靠的佐劑之一,可刺激機體產生高滴度的抗體。蜂膠內含多種生物活性物質,配合抗原注入機體,可增強補體功能、增強免疫功能細胞及吞噬細胞數量,促進抗體產生,從而增強免疫功能。但蜂膠佐劑的劑型較多,制法不一,并且不同工藝制備的蜂膠佐劑,對免疫作用的影響程度也不一樣[3]。鋁膠佐劑主要誘導體液免疫應答,不能明顯地誘導細胞介導免疫應答。鋁膠佐劑在注射部位緩慢釋放抗原物質的效應較弱,因而佐劑活性較低,并且對許多抗原的免疫促進作用都不明顯。由試驗結果可見,RA油乳劑滅活疫苗的免疫保護率效果最好,其次是蜂膠滅活疫苗,最差的是鋁膠滅活疫苗。在270d的保存期內6次免疫試驗,任何一次油乳劑滅活疫苗的免疫保護率都高于蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗,同比,蜂膠滅活疫苗稍優于鋁膠滅活疫苗。這一結果與3種佐劑的基本特性相吻合。

3.2 相同佐劑不同保存時間RA滅活疫苗免疫效果的比較 RA油乳劑滅活疫苗從90d至270d不同保存時間的疫苗免疫保護率在71.4%～100%之間;疫苗保存270d高達100%,表明油乳劑滅活疫苗的有效保存時間最少可達270d;但90d、150d和240d疫苗免疫保護率出現波動,其原因可能由于不同保存期RA油乳劑滅活疫苗制備過程中存在誤差,誘導機體產生抗體水平存在差異。蜂膠滅活疫苗免疫保護率基本隨著保存時間的增長,表現下降趨勢(42.9%～71.4%)。鋁膠滅活疫苗免疫效果基本與保存時間成反比關系,下降趨勢比蜂膠滅活疫苗更明顯(33.3%～71.4%),提示 RA油乳劑滅活疫苗保存穩定性較好,蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗保存穩定性較差。

3.3 免疫注射局部反應 經試驗觀察,注射油乳劑滅活疫苗組鴨,注射部位的肌肉可見一綠豆大小的硬塊,硬塊通常隨生長增長而消退,蜂膠和鋁膠滅活疫苗組鴨注射部位未見紅腫。由此可見3種RA滅活疫苗無明顯副反應。

3.4 依據3種不同佐劑滅活疫苗免疫保護率的高低及其對雛鴨的副作用大小,建議廣大養殖戶選用油乳滅活疫苗對鴨疫里默氏菌病進行免疫防治。

[1]姜平.獸醫生物制品學[M].北京：中國農業出版社,2003：71-72.

[2]高福,郭玉璞.小鴨傳染性漿膜炎疫苗的研究[J].中國獸醫雜志,1987,13(6)：51-53.

[3]齊雪峰,楊曉燕,羅薇,等.幾種新型佐劑的研究近況及存在問題[J].中國家禽,2003,25(22)：44-45.