青海省綿羊弓形蟲病的ELISA診斷方法的建立及血清學調查

蔡其剛，馬利青

(青海省畜牧獸醫科學院，青海西寧810016)

龔地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內寄生的重要機會致病性原蟲，可寄生于人和動物的除紅細胞外的有核細胞內，引起弓形蟲病(Toxoplasmosis)[1]。貓及貓科動物是惟一可從糞便排出弓形蟲卵囊的動物，貓在弓形蟲傳播給綿羊和其他動物中起著重要作用。

P30蛋白又稱表面抗原1(SAG1)，為龔地弓形蟲速殖子期特異性蛋白，能夠刺激機體產生IgG、IgM及多種細胞因子，具有重要的抗原性[2]。Dzierszinski F等根據基因敲除試驗認為P30可能是決定蟲株毒力的重要因素之一[3]。為了摸清青海省綿羊中弓形蟲病的感染情況，我們運用分子生物學方法克隆、表達、純化重組 GST-SAG1，然后以GST-SAG1作為 ELISA診斷抗原，建立了 ELISA診斷試劑盒，利用建立的 ELISA方法對采自青海省的綿羊進行了弓形蟲病的血清學診斷，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 抗原：GST-SAG1由日本國家原生動物疾病研究控制中心提供，青海省畜牧獸醫科學院獸醫研究所生物技術研究室保存。

陰、陽性血清：均為日本國家原生動物疾病研究中心玄學南教授惠贈，青海省畜牧獸醫科學院獸醫生物技術室保存。

被檢血清：2 402份被檢血清均采自青海省，以頸靜脈采集，采集后立即離心(3 000 r/min離心15 min)，血清析出后進行收集，-20℃冷凍保存待檢。

其他試劑和耗材：均購自國內和Sigma公司供應商。

1.2 重組蛋白的表達、純化 將編碼 T.gondii SAG1的基因克隆至pGEX-4T-3質粒，然后轉化到E.coli，獲得 GST-SAG1融合蛋白。GST-SAG1融合蛋白再用8 mol/L的尿素緩沖液透析復性，然后用于T.gondii的 ELISA診斷中。

1.3 抗原的包被 抗原GST-SAG1和GST，分別按5 μ g/mL劑量加到包被液中(50 mmol/L Carbonate-Bicarbonate Buffer，pH 9.6)，混勻后加到96孔平底微量板(Castor)的孔里，每孔 50 μ L，并且在4℃條件下培養過夜。

1.4 封阻 用含有0.05%Tween-20的 1×PBS沖洗1次后，用含3%脫脂乳的封阻液(3 g脫脂奶粉+90 mL蒸餾水+10 mL 10×PBS)進行封阻，每孔 100 μ L，并在 37℃條件下培養 1 h。

1.5 加樣 微量板用PBS沖洗1次，在封阻液中按1∶100滴度稀釋陰、陽性標準血清、被檢血清后，每個樣品平行加到微量板的兩個孔中，每孔50 μ L，并在37℃條件下培養1 h。

1.6 加二抗 用PBS沖洗 6次后，在封阻液中按1∶4 000滴度稀釋辣根過氧化物酶標記兔抗羊的IgG 抗體(Bethyl Laboratories，USA)，稀釋后每孔加 50 μ L，并在 37℃條件下培養 1 h。

1.7 底物 用PBS沖洗6次后，每孔加 100 μ L底物(每1 mL 底物中含有 0.3 μ g ABTS，0.1 mol/L檸檬酸緩沖液pH 4.0和 0.003%H2O2)，在室溫陰暗處放置1 h后讀數。

1.8 讀數 用 Wellscan MK 3酶標儀(Labsystems Dragon，Finland)在 OD415 nm條件下測定光吸收值(OD)。

1.9 判定標準 ELISA滴度表示成最大稀釋度的倒數，且展示ELISA值是等于或大于0.1，在抗原GST-SAG1孔和GST孔之間的光密度吸收值是不同的，兩孔陰性血清對照孔的平均值必須低于0.1，樣品ELISA抗體滴度值等于或大于0.1為陽性，低于0.1為陰性。

2 結果

對所收集的2 402份綿羊血清樣品應用所建立的ELISA診斷試劑盒進行血清學診斷，其中：土種綿羊血清 1 392份，檢出 25份陽性，陽性率為1.80%；改良綿羊血清786份，檢出27份陽性，陽性率為3.44%；小尾寒羊血清224份，檢出4份陽性，陽性率為1.79%。表明青海省的綿羊群中存在弓形蟲病的感染，見表1。

表1 弓形蟲ELISA診斷試劑盒的檢測結果

3 討論

3.1 本次共檢驗2 402份綿羊血清，檢出陽性數56份，陽性率為2.33%。其中：土種綿羊、改良綿羊和小尾寒羊的陽性率分別為 1.80%、3.44%和1.79%，本次調查結果表明，在青海省的綿羊群中存在弓形蟲的感染。弓形蟲的感染是否存在不同種群的易感性，有待于今后進一步的研究。

3.2 加強弓形蟲病的檢疫淘汰，加強牧戶中貓的管理、搞好環境衛生，力爭將弓形蟲病的危害降到最低程度。據報道，感染了弓形蟲的羊在人類弓形蟲病的傳播上有特殊作用[4]。因此，做好羊的弓形蟲病檢測及控制對防止人類弓形蟲病的發生有著重要的意義。

3.3 對弓形蟲病的治療藥物仍以磺胺類藥物和抗菌增效劑聯合使用療效最好。一些新的化療藥物對治療弓形蟲病具有良好的效果，但目前治療藥物的研究主要針對人弓形蟲病及小鼠弓形蟲病的模型建立，在弓形蟲病的治療方法上進展不大，所以應盡快評價這些藥物治療弓形蟲病的效果。

3.4 目前，國內外專家學者已對弓形蟲病的流行、病原形態、生活史、診斷和免疫等方面做了大量研究工作，并取得了一定成績。但用于預防弓形蟲病發生的有效生物制劑尚需進一步研究，對其發病機理和動物模型的研究，是為進一步開發診斷試劑和建立有效控制方法的基礎。

[1] El Kouni M H.Adenosine metabolism in Toxoplasma gondii：potential targets for chemotherapy[J].CurrPharJ-Teisai Des，2007，13(6)：581-597.

[2] Seng S，Makala L H，Yokoyama M ，et al.SAG1 is a hosttargeted antigen for protection against Toxoplasma gondii infection[J].Pathobiology，2004，71(3)：144-151.

[3] Dzierszinski F，Mortuaire M，Cesbron-Delauw M F，et al.Targeted disruption of the glycosylpho sphatidy linositol-anchored surface antigen SAG3 gene in Toxoplasma gondii decreases host cell adhesion and drastically reduces virulence in mice[J].Mol Microbiol，2000，37(3)：574-582.

[4] 原永海，馬利青.小尾寒羊弓形蟲病血清抗體檢測[J].中國獸醫雜志，2007，43(8)：44.