補(bǔ)骨脂淫羊藿總黃酮對(duì)兔成骨細(xì)胞增殖及抗氧化作用的影響

邱印利,劉 娟

(西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系,重慶 榮昌 402460)

中醫(yī)認(rèn)為,腎藏精,精生髓,髓養(yǎng)骨而通于腦。補(bǔ)腎壯陽(yáng)中藥補(bǔ)骨脂、淫羊藿具有補(bǔ)腎壯陽(yáng),益精健骨的功效,現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究結(jié)果表明,補(bǔ)骨脂、淫羊藿具有廣泛的藥理作用,對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等都有很好的調(diào)理作用[1]。淫羊藿主要化學(xué)成分為黃酮類(lèi)化合物,包括淫羊藿苷、淫羊藿次苷、脫水淫羊藿素等[1]。補(bǔ)骨脂中含有多種活性成分,到目前為止,國(guó)內(nèi)外研究人員已從補(bǔ)骨脂中分離出香豆素類(lèi)、黃酮類(lèi)、單萜酚類(lèi),以及豆甾醇、谷甾醇葡萄糖苷,十三烷等化合物40余種[2],其中,香豆素類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物是其主要成分。補(bǔ)骨脂、淫羊藿黃酮類(lèi)有抗氧化作用[3-4]。林舉擇等用MT T法測(cè)定補(bǔ)骨脂注射液對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響,顯示補(bǔ)骨脂對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞的增殖有顯著促進(jìn)作用[5]。但還未見(jiàn)補(bǔ)骨脂、淫羊藿總黃酮對(duì)成骨細(xì)胞影響的報(bào)道,因此本次試驗(yàn)擬提取補(bǔ)骨脂、淫羊藿總黃酮,并測(cè)定對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響,以期為其補(bǔ)腎功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基(Initrogen Corporation USA),MT T(Sigma 14024),標(biāo)準(zhǔn)新生牛血清(鄭州佰安生物工程有限公司),SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所,20080826),MDA測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,20080826),胰蛋白酶(美國(guó)ICN),TE2000-S倒置顯微鏡(Nikon),680型酶標(biāo)儀(Bio-Rad laboratories Ltd.USA),SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化),3111型隔水式二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation USA),補(bǔ)骨脂、淫羊藿總黃酮(由本校中藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室提取鑒定)。

1.2 兔成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)與純化[6]處死初生的兔仔,75%酒精浸泡5 min后,無(wú)菌條件下取其顱蓋骨,刮去軟組織,無(wú)菌Hank′s液(含青霉素 3×105IU/L、鏈霉素 3×105μg/L)沖洗后 ,剪成約1 mm3大小的碎塊,0.25%胰蛋白酶,37℃下攪拌消化15 min,棄消化液,無(wú)血清培養(yǎng)液反復(fù)吹打清洗后,將組織塊均勻鋪在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底,加少量含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液,倒置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱,4 h后,小心添加足量1640完全培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),每3天換液1次。細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底時(shí),0.25%胰蛋白酶消化,細(xì)胞懸液先接種到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),5 min后輕吸出含未貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液,再接種于另一培養(yǎng)瓶中,重復(fù)這一操作3次,純化成骨細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)用第3代細(xì)胞進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.3 MT T法測(cè)定補(bǔ)骨脂、淫羊藿總黃酮對(duì)正常兔成骨細(xì)胞增殖的影響 RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的成骨細(xì)胞消化傳代后,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL,然后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入180μL該培養(yǎng)液,放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后(顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況),待細(xì)胞生長(zhǎng)合適后,棄去96孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液,加入無(wú)血清的培養(yǎng)基180μL,然后分別加入藥液(濃度為 1×10-6g/L、1×10-7g/L、1×10-8g/L)20μL,待其分別作用 6 h后,每孔加M TT溶液20μL繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150μL二甲基亞砜,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分融解。然后選擇490 nm波長(zhǎng),在酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光吸收值。

1.4 MT T法補(bǔ)骨脂、淫羊藿總黃酮對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞增殖的影響[7]成骨細(xì)胞用含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成 1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,以200μL/孔加入96孔培養(yǎng)板,24 h后吸棄培養(yǎng)液;隨機(jī)分成空白對(duì)照組、損傷模型組、試驗(yàn)組。空白對(duì)照組:加入無(wú)血清的培養(yǎng)基200μL培養(yǎng)24 h;損傷模型組:加入無(wú)血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后,加入含終濃度為150 μ mol/mL的H2O2的細(xì)胞培養(yǎng)液作用 30 min;試驗(yàn)組:加入無(wú)血清的培養(yǎng)基180μL,然后分別加入濃度為1.0×10-6g/L藥液20μL,培養(yǎng) 24 h 后,加 150 μ mol/mL 的 H2O2作用30 min;取培養(yǎng)液上清液待用。然后按照測(cè)定正常細(xì)胞增殖的MT T法對(duì)各組細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行測(cè)定。

1.5 補(bǔ)骨脂、淫羊藿總黃酮對(duì)成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活力及MDA含量的影響 用1.4項(xiàng)培養(yǎng)液測(cè)定SOD活力和MDA含量。SOD活力測(cè)定:采用黃嘌呤氧化酶法,操作步驟按SOD測(cè)試盒說(shuō)明進(jìn)行,取樣量為100μL,用雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于550 nm處測(cè)定A值,通過(guò)公式計(jì)算細(xì)胞SOD活性。MDA含量測(cè)定:采用試劑盒介紹的 TBA法 ,單位為 μ mol/L 。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS10.0軟件處理,參數(shù)值用表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂、淫羊藿總黃酮對(duì)正常兔成骨細(xì)胞增殖的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示,空白組的兔成骨細(xì)胞在490 nm處A值為0.175;當(dāng)補(bǔ)骨脂總黃酮濃度為1.0×10-6g/L、1.0×10-7g/L、1.0×10-8g/L 時(shí),其細(xì)胞在490 nm處 A值分別為0.207、0.235、0.230;當(dāng)淫羊藿總黃酮濃度為 1.0×10-6g/L、1.0×10-7g/L、1.0×10-8g/L 時(shí),其細(xì)胞 OD490值分別為0.217、0.241、0.233。補(bǔ)骨脂、淫羊藿總黃酮二組與空白組比較均有極顯著性差異(P＜0.01)。且補(bǔ)骨脂總黃酮、淫羊藿總黃酮在濃度為1.0×10-7g/L對(duì)成骨細(xì)胞增殖效果最佳,見(jiàn)表1。

表1 補(bǔ)骨脂淫羊藿總黃酮對(duì)正常兔成骨細(xì)胞增殖的影響 (n=8,A490,)

表1 補(bǔ)骨脂淫羊藿總黃酮對(duì)正常兔成骨細(xì)胞增殖的影響 (n=8,A490,)

**:與空白組比較,呈差異極顯著(P＜0.01)

2.2 補(bǔ)骨脂、淫羊藿總黃酮對(duì)氧化損傷兔成骨細(xì)胞增殖的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組細(xì)胞減少,A值與空白組相比有顯著性差異(P＜0.05)。補(bǔ)骨脂、淫羊藿總黃酮細(xì)胞增殖,兩組細(xì)胞在490 nm處A值分別為0.197、0.208,與模型組相比均有顯著性差異(P＜0.05),見(jiàn)表2。

表2 補(bǔ)骨脂淫羊藿總黃酮對(duì)氧化損傷兔成骨細(xì)胞增殖的影響(n=8,A490:)

表2 補(bǔ)骨脂淫羊藿總黃酮對(duì)氧化損傷兔成骨細(xì)胞增殖的影響(n=8,A490:)

*:與空白組比較,呈顯著性差異(P＜0.05);△:與模型組比較,呈顯著性差異(P＜0.05)。下表同

2.3 補(bǔ)骨脂、淫羊藿總黃酮對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性及MDA含量的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示,H2O2所致氧化損傷模型組中SOD活力為7.56 U/m,MDA含量為3.54 nmol/mL,模型組與空白對(duì)照組相比均有顯著性差異;補(bǔ)骨脂、淫羊藿總黃酮組SOD活力增加及MDA含量降低,與模型組比較均有顯著性差異,見(jiàn)表3。

表3 補(bǔ)骨脂淫羊藿總黃酮對(duì)SOD活性及MDA含量的影響 (n=6)

3 討論

3.1 補(bǔ)骨脂具有溫腎助陽(yáng)、納氣、止瀉的功效;現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其有免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、平喘等作用。淫羊藿具有益精健骨、補(bǔ)腎作用、能促進(jìn)造血功能、免疫功能及骨代謝,具有抗衰老、抗腫瘤等功效。根據(jù)“肝主筋,腎主骨”的中醫(yī)理論,腎精不足,腎氣虛衰是導(dǎo)致原發(fā)性骨質(zhì)疏松的重要原因,用來(lái)治療骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)藥組方多從補(bǔ)腎入手,調(diào)節(jié)人體陰陽(yáng)平衡,補(bǔ)氣助陽(yáng),強(qiáng)筋健骨[8]。骨質(zhì)疏松癥(OP)是以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化為特征,以致骨的脆性增高而骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身代謝性骨病[9]。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞,成骨細(xì)胞增殖受抑制及分化程度降低,是造成骨質(zhì)疏松癥的重要原因之一。只有成骨細(xì)胞不斷增殖及分化才能產(chǎn)生豐富的骨膠原蛋白和非膠原性蛋白質(zhì),從而進(jìn)一步形成更多的骨組織。因此刺激成骨細(xì)胞形成的藥物可能具有獨(dú)特的抗骨質(zhì)疏松的特性。

3.2 MT T比色法[9]測(cè)定原理是細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞能量代謝旺盛時(shí),在線粒體能量代謝過(guò)程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的四甲基氮唑鹽MT T還原成為藍(lán)紫色不溶于水的結(jié)晶,形成的結(jié)晶與增殖的細(xì)胞數(shù)成正比,其最大吸收峰在490 nm處,用該波長(zhǎng)測(cè)定溶液吸光度值(A值)能直接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量和其新陳代謝強(qiáng)度。本次試驗(yàn)應(yīng)用MTT比色法測(cè)定不同濃度的淫羊藿、補(bǔ)骨脂總黃酮對(duì)成骨細(xì)胞的增殖影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),淫羊藿、補(bǔ)骨脂對(duì)成骨細(xì)胞的增殖均有明顯效果,與空白對(duì)照組相比有極顯著差異,在1.0×10-7g/L效果最佳。

3.3 黃酮類(lèi)化合物亦稱(chēng)類(lèi)黃酮或生物類(lèi)黃酮,主要是指基本母核為2-苯基色原酮類(lèi)化合物,目前黃酮類(lèi)化合物已達(dá)8000多種[10]。黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是皆有一個(gè)三環(huán)的核心,其基本結(jié)構(gòu)式由兩個(gè)苯環(huán)(A和B)通過(guò)中間雜環(huán)的吡喃或吡喃酮(C)相連接[11-12]。黃酮類(lèi)化合物特殊的結(jié)構(gòu)賦予它一系列獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì),如能與多種金屬離子發(fā)生絡(luò)合或靜電作用;具有還原性和捕獲自由基的特性;能與蛋白質(zhì)結(jié)合;具有兩親結(jié)構(gòu)和諸多衍生化反應(yīng)活性等等。黃酮類(lèi)物質(zhì)所具有的優(yōu)秀的抗氧化活性正是這些基本化學(xué)性質(zhì)的綜合體現(xiàn)。本次試驗(yàn)證明淫羊藿、補(bǔ)骨脂總黃酮能減少兔成骨細(xì)胞氧化損傷,起到抗氧化保護(hù)作用,提示淫羊藿、補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎健骨作用可能與其總黃酮抗氧化減少成骨細(xì)胞氧化損傷有關(guān),其機(jī)理有待進(jìn)一步探討。

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