復方伊維菌素和吡喹酮注射液的研制

牛麗娟,湯樹生,郭召旭,陳琳琳,趙婷婷,聶 嚴,萬仁玲,肖希龍

(1.中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193;2.中國獸醫藥品監察所,北京 海淀 100081)

近年來,由于線蟲、絳蟲、吸蟲以及體外寄生蟲等多種不同類型寄生蟲混合感染增多[1-3],使獸醫臨床迫切需要對上述多種寄生蟲均有效的抗寄生蟲新型復方制劑,而我國抗寄生蟲復方制劑的研究基本處于空白階段,至今未有效果較好的抗寄生蟲復方制劑上市。因此,在我國研制對多種不同類型寄生蟲感染均有效的抗寄生蟲新型復方制劑已迫在眉睫。本文的研究目的是以當前獸醫臨床常用的伊維菌素(主治線蟲和體外寄生蟲)和吡喹酮(主治絳蟲和吸蟲)為主要原料,研制伊維菌素和吡喹酮的復方注射液,為我國獸醫臨床提供一種使用方便且對動物寄生蟲混合感染具有較好療效的抗寄生蟲復方制劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 伊維菌素(96.2%)和吡喹酮(99.6%)原藥系浙江海正藥業股份有限公司饋贈;伊維菌素對照品(94%,Sigma公司);吡喹酮對照品(99.5%),中國獸醫藥品監察所。

1.2 復方注射劑的研制 從多種有機溶劑中篩選出對伊維菌素和吡喹酮均有較好溶解性能,且無配伍禁忌和變色反應的溶劑作為本注射液的溶劑體系;從多種常用抗氧化劑和止痛劑中篩選出適合本制劑的理想抗氧化劑和止痛劑等適宜助劑。

1.3 正交試驗 為確定所選抗氧化劑和止痛劑的最佳用量,各對其設高、中、低3個水平按正交表L9(34)進行正交試驗,正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.4 伊維菌素含量檢測方法

1.4.1 色譜條件 紫外檢測器;色譜柱(SHIMADZU UP-ODS,5 μ m,150 ×4.6 mm);流動相 :乙腈∶甲醇∶水(53∶35∶12);流速:1.5mL/min;檢測波長:245 nm;進樣量:20μL。

1.4.2 標準曲線制作 精密稱量伊維菌素對照品用甲醇溶解并定容成880μg/mL儲備液,倍比稀釋后得標準工作液(27.5～880μg/mL)進 HPLC測定,以峰面積對濃度繪制標準曲線。

1.5 吡喹酮含量檢測方法

1.5.1 色譜條件 紫外檢測器;色譜柱:Intertsil C18柱(5 μ m,250 ×4.6 mm,DIKMA 公司);流動相:甲醇∶水(97∶3);流速:1.0mL/min;檢測波長:263 nm;進樣量:10μL 。

1.5.2 標準曲線制作 精密稱量吡喹酮對照品用甲醇溶解并定容成為5.9 mg/mL儲備液,稀釋后得標準工作液(0.118～5.9μg/mL)進 HPLC測定,以峰面積對濃度繪制標準曲線。

1.6 回收率試驗 配方中伊維菌素和吡喹酮含量分別為0.25%和6%,回收率試驗時分別在空白注射液(不含伊維菌素和吡喹酮的空白制劑)中添加伊維菌素和吡喹酮至配方濃度。

1.7 樣品前處理 制劑樣品和添加樣品的前處理方法相同,具體步驟如下:將樣品搖勻,用移液管取出2mL樣品于25mL容量瓶內,用甲醇溶解,定容,微孔濾膜過濾,進樣。

1.8 穩定性試驗

1.8.1 光加速試驗 取復方注射液3批樣品,置照度為4500±500 Lx的條件下放置10 d,分別于5 d、10 d定時取樣,考察樣品外觀色澤、含量、澄明度、降解產物、不溶性微粒等指標。

1.8.2 溫濕加速試驗 取3批制劑樣品,在溫度40℃±2℃,相對濕度 75%±5%的條件放置6個月。每月取樣1次,考察樣品外觀色澤、含量、澄明度、降解產物、不溶性微粒等指標。

2 結果與分析

2.1 復方注射液的研制

2.1.1 溶劑體系篩選結果 試驗結果顯示,吡喹酮在丙二醇、吡咯烷酮、二甲基甲酰胺等溶劑中溶解度較高,但吡喹酮經吡咯烷酮溶解后易出現變色反應;伊維菌素在有機溶劑中極易溶解,但用聚乙二醇、無水乙醇、甘油等溶解后易出現結晶或雪花狀沉淀。經反復多次篩選,最終確定丙二醇和二甲基乙酰胺按適宜比例的混合溶劑體系可達到較理想的溶解效果。

2.1.2 助劑篩選結果 篩選結果表明,本制劑的適宜抗氧化劑和止痛劑分別為二叔丁基羥基甲苯和利多卡因。若選用叔丁基羥基茴香醚為抗氧劑,所制得樣品易出現變粉現象,而用生育酚為抗氧化劑則因其出峰時間與吡喹酮出峰時間有重疊,分離效果差。利多卡因被選為本制劑的最終止痛劑的優勢是刺激性較小且溶解性能極好,同時不影響吡喹酮的分離效果。

2.1.3 正交試驗結果 數據用最大極差法處理,結果顯示,最佳配方組合是抗氧化劑為0.2%、止痛劑為0.9%的配方。從兩者的極差值(R值)可知,抗氧化劑(R=0.49)和止痛劑(R=0.41)對制劑質量的影響差別不大,但抗氧化劑的水平對制劑質量的影響稍大些。

2.2 制劑藥物含量檢測方法 制劑中伊維菌素和吡喹酮的含量檢測方法在其相應的濃度范圍內均呈良好線性關系,線性方程分別為Y=26609.64X+75675.17(r=0.9999)和Y=829000X+16500(r=0.9998)。3批伊維菌素添加樣的回收率分別為89.1%、93.6%、102.4%,變異系數為 3.5%;3批吡喹酮添加樣的回收率分別為95.2%、99.3%、103.3%,變異系數為4.1%。

2.3 穩定性試驗結果

2.3.1 光加速試驗結果 光加速試驗結果見表2,在強光照射前三批復方注射液均為無色澄明液體,經強光照射10 d,樣品的澄明度無明顯變化,但3批樣品的色澤在第5天時變為淡黃色,至第10天時3批樣品均變為深黃色。制劑中的藥物含量亦有部分下降,但仍在規定范圍內,其中伊維菌素和吡喹酮的含量下降范圍分別在3.6%和2.9%之內。

表2 復方注射液光加速試驗結果 (實測量/標示量,%)

2.3.2 溫濕加速試驗結果 溫濕加速試驗結果見表3,在溫濕加速試驗前后,3批復方注射液均為無色澄明液體,外觀色澤和澄明度均無明顯變化。雖然制劑中藥物含量有所下降,但均在允許范圍內,其中伊維菌素和吡喹酮的下降范圍分別為5.2%和3.2%之內。

表3 復方注射液溫濕加速試驗結果 (實測量/標示量,%)

3 討論

3.1 關于復方注射液的研制 當今市場上雖已有一些國外伊維菌素和吡喹酮復方制劑,但均為口服制劑,生物利用度低;國內于詠蘭[4]亦曾研制了伊維菌素和吡喹酮復方混懸液,但混懸注射液不易注射,且具較大刺激性。為克服上述不足之處,本文經反復多次試驗,成功篩選出適宜的溶劑體系及理想的抗氧化劑和止痛劑,研制出工藝簡單、操作方便、刺激性小的伊維菌素和吡喹酮復方注射液,為獸醫臨床提供了一種理想的防治動物寄生蟲混合感染的抗寄生蟲復方制劑。

3.2 關于制劑中藥物含量檢測方法 因本制劑中輔料成分較多,且吡喹酮因極性小而出峰時間早[5-6],因此建立制劑中藥物含量檢測方法的難點在于如何將伊維菌素和吡喹酮與制劑中輔料成分成功分離。本文以《中華人民共和國獸藥典》(2005年版)為基礎,查閱國外相關文獻[5-8]后成功建立了制劑中伊維菌素和吡喹酮含量的HPLC檢測方法。本文建立的方法具有如下優點:①樣品前處理方法簡單,且樣品處理后48 h內仍具有極好的穩定性;②分析時間短(每個樣品都可以在20 min之內完成分析)。由于本制劑是伊維菌素和吡喹酮復方制劑,如能建立同時檢測制劑中兩藥含量的方法將大大減少工作量,因此,本實驗室現正在摸索兩藥同時檢測的方法。

3.3 關于制劑的穩定性 本制劑在強光照射第5天時開始有變色現象,雖然制劑澄明度無明顯變化,且制劑中伊維菌素和吡喹酮的含量下降仍在規定范圍內,但為保證產品質量,本制劑宜避光保存。溫濕加速試驗顯示,本制劑在溫度40℃±2℃,相對濕度75%±5%條件下放置6個月后其外觀色澤和澄明度均無明顯變化。雖然制劑中藥物含量有所下降,但均在允許范圍內,結果表明,制劑在恒溫恒濕條件下放置6個月穩定性良好。目前長期穩定性試驗正在進行中,制劑的有效期最終將結合濕溫加速試驗結果和長期穩定性試驗結果確定。

[1]惠禹,王珂玉.張家川縣人畜共患寄生蟲調查[J].中國獸醫寄生蟲病,2001,1:144-146.

[2]張海英,劉世輝,趙豐文.民和縣黃牛內寄生蟲感染情況調查[J].青海畜牧獸醫雜志,2007,4:28.

[3]李永剛,包彩玲,靳兆江.齊齊哈爾市綿羊寄生蟲病流行因素分析與防治措施[J].中國獸醫寄生蟲病,2005,4:140-141.

[4]于詠蘭.寵物用復方驅蟲劑的研制[D].北京:中國農業大學,2007.

[5]Hanpitakpong W,Banmairuroi V,Kamanikom B,et al.A high-perfo rmance liquid chromatographic method for determination of praziquantel in plasma[J].J Pharm Bio Med Ana1,2004,36:871-874.

[6]Dirk S,Gottfried B.Isolation and identification of 8-hydroxypraziquantel as a metabolite of the antischistosomal drug praziquantel[J].J Pharm Bio Med Ana1,2001,26:791-799.

[7]Andreas M A,Le Chung,David G M.Development and validation of an automated extraction method(accelerated solvent ex traction?)and a reverse-phase HPLC analysis method for assay of ivermectin in a meat-based chewable formulation[J].J Pharm Bio Med Ana1,2003,31:1177-1183.

[8]Lifschitz A.Pharmacokinetic evaluation of four ivermectin generic formulations in calves[J].Vet Parasitol,2004,119:247-257.