RASSF1A基因在結直腸癌中的表達及臨床意義

朱崎 肖偉升 歐瑜 廖愛軍

RASSF1(Ras-assotiation domain family1)即Ras相關區域家族1基因，是Dammann以及 Lerman分別在2000年從肺癌細胞株3號染色體短臂克隆的新型候選抑癌基因[1-2]，它有多種不同mRNA剪接體，包括RASSF1A/B/C。研究表明，RASSF1A在所有的正常組織中均表達，但是在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、腎癌、前列腺癌和膀膚癌等絕大多數腫瘤中卻表達缺失，目前研究表明，胃癌中46%癌組織和33%的細胞系中存在RASSFIA表達缺失，與腫瘤分級、分期有關，但與組織學類型無關[3]。有作者研究胃癌、胃腺瘤、腸上皮化生、慢性胃炎四種病變的甲基化譜，發現RASSFIA啟動子甲基化只見于胃癌中[4]。這些研究結果提示RAssFIA表達缺失在胃癌發生發展中是常見事件，可能在胃癌發生發展中扮演了重要角色。但RASSF1A基因與結直腸癌是否相關尚未見相關報道。本實驗通過RT-PCR檢測結直腸癌中RASSF1A的表達水平探討RASSF1A基因與結直腸癌的關系。

1 材料及方法

1.1 病例標本來源 來自2009年5月～9月我院腫瘤外科結直腸癌手術患者，共40例，40例病例中男24例，女16例，年齡在26～68歲。所有標本均經兩名高年資病理醫師閱片確診，取距離腫瘤邊緣5cm外組織作為正常對照。所有標本均保存在-180℃液氮中待用。組織標本按TNM分期。按組織分化分級。

1.2 組織總RNA的提取 按照Trizol試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)操作說明書提取總RNA。

1.3 逆轉錄合成cDNA 按照AMV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工)操作說明書，取上述提取的總RNA5μl、Oligo(dT)12～181μl、去離子水6μl，共置于PCR管中，渦旋器上輕微混勻3～5s，以上均冰上操作。70℃孵育5min后，冰上冷卻，4000r/min離心10s。然后分別加入5×反應緩沖液4μl，RNA酶抑制劑(20u/μl)1μl，10mmol/L)dNTP2μl，混勻，4000r/min離心10 s，收集產物。42℃孵育5min。加AMV逆轉錄酶(200u/μl)1μl,終體積為20μl。42℃孵育60min。70℃加熱10min。置-20℃保存。

1.4 PCR擴增 根據相關文獻合成擴增RASSF1A的引物：上游引物5′-TCT GGG GCG TCG TGC GCA AA-3′，下游引物5′-GAA CCT TGA TGA AGC CTG TG-3′，擴增產物長285bp；以在各種組織中穩定表達的β-actin作為內參，上下游引物分別為：5′-ACC CAG ATC ATG TTT GAG ACC-3′，5′-GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG-3′，擴增產物長486bp。按照PCR擴增試劑盒(上海生工)的操作說明書進行。反應條件：95℃預變性4min；95℃變性30sec；60℃退火30s，72℃延伸1min，共32個循環；72℃延伸5min。產物置-20℃保存。

1.5 瓊脂糖電泳 擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用BIO-RAD圖象分析儀掃描記錄。

1.6 統計學方法 采用x2檢驗和秩和檢驗。

2 結果

2.1 RASSF1A基因在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達RASSF1A mRNA在40例結直腸癌組織中有90.0%(36/40)表達缺失；而只有12.5%(5/40)癌旁正常組織中存在表達缺失，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

2.2 RASSF1A基因在結直腸癌中的表達與組織分化、臨床病理的關系RASSF1A基因mRNA表達缺失與結直腸癌組織分化程度可能不相關，高分化、中分化、低分化比較無統計學差異(P＞0.05)，與結直腸癌病理分期可能不相關，病理分期間比較無統計學差異(P＞0.05)。見表1。

圖1 RASSF1A基因在結直腸癌中的表達

3 討論

RASSF1A目前被認為是一個新型的抑癌基因，首先在肺癌中發現，并且隨著對RASSF1A基因研究的不斷深入，人們發現RASSF1A通過多種途徑抑制腫瘤的形成，而其失活參與了腫瘤的發生、發展過程，研究已經在乳腺癌，前列腺癌，鼻咽癌，卵巢癌，黑色素瘤，淋巴瘤，膀胱癌，胃癌等腫瘤中發現了RASSF1A的表達缺失或表達下調。

表1 RASSF1A基因mRNA在結直腸癌中的表達

RASSF1A被認為是一種Ras效應分子，通過RAS結構域與Ras-GTP結合，誘導細胞凋亡[5]。在正常的細胞中，Ras的這兩種效應可能通過動態的平衡來維系細胞正常生長，而在腫瘤中因甲基化所引起的RASSF1A表達缺失可能使Ras更多的發揮促進細胞生長效應而最終導致腫瘤發生。PallarésJ等[6]在子宮內膜癌的研究中發現RASSF1A通過Ras-MAPK通路影響細胞增殖及凋亡。YooYA等[7-8]發現RASSF1A能抑制H-Ras誘導的JNK活性。Thaler等[9]在最近的研究中發現RASSF1A能調節Ras介導的Raf-MEK-ERK信號通路，從而影響細胞周期及衰老。RASSF1A作為Ras的一種效應分子已經得到證實。而進一步研究表明RASSF1A可通過MST1(Mammalian sterile20likekinase 1)[10-12]、支架蛋白CNK1(connector enhancer of KSR)[13]、MOAP1(modulator of apoptosis-1，一種Bax結合蛋白)[14-16]、Cyclin D1(細胞周期蛋白D1)[7-17]、CDC20(cell division cycle control protein20,細胞分化周期調控蛋白20)[18-19]影響細胞的凋亡，并且認為RASSF1A還能通過ATM磷酸化位點調節細胞穩定性[20-21]。

這些研究表明了RASSF1A基因能抑制腫瘤的生長，誘導凋亡，是腫瘤的發病機制，但RASSF1A基因是否在結直腸癌中也存在著表達缺失，RASSF1A基因是否是結直腸癌的抑癌基因，目前國內外尚無研究。我們的實驗結果表明：結直腸癌旁組織的RASSF1A基因mRNA表達的缺失率(90%)明顯高于癌組織(12.5%,P＜0.05)。這說明RASSF1A基因可能與結直腸癌相關，并且可能是結直腸癌的一個抑癌基因。進一步研究表明：RASSF1A基因的表達與結直腸癌的組織分化及病理分期間無明顯關系(P值均＞0.05)這可能說明RASSF1A基因與結直腸癌的組織分化及病理分期關系不大，但也有研究表明在RASSF1A基因與胃癌的進展相關，RASSF1A基因是否確定與結直腸癌的組織分化及病理分期無關，需進一步擴大標本量來證明。

[1]Dammann R,Li C,Yoon JH,et al.Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3[J].Nat Genet,2000;25(3):315-319.

[2]Lerman MI,Minna JD.The 630-kb lung cancer homozygous deletion region on human chromosome 3p21.3:identification and evaluation of the resident candidate tumor suppre-ssor genes.The International Lung Cancer Chromosome 3p21.3 Tumor Suppressor Gene Consortium[J].Cancer Res,2000,60(21):6116-6133.

[3]Byun DS,Lee MG,Chae KS,et al.Frequent epigenetic inactivation of RASSFIA by aberrant promoter hypermethylation in human gastric adenocarcinoma[J].Cancer Res,2001,61(19):7034-7038.

[4]Kang GH,Lee S,Kim JS,et al.Profile of aberrant CpG island methylation along multistep gastric carcinogenesis[J].Lab Invest,2003;83(4):519-526.

[5]Khokhlatchev A,Rabizadeh S,Xavier R,et al.Identification of a novel Ras-regulated proapoptotic pathway[J].Curr Bio,2002;12(4):253- 265.

[6]Pallarés J,Velasco A,Eritja N,et al.Promoter hypermethylation and reduced expression of RASSF1A are frequent molecular alterations of endometrial carcinoma[J].Mod Pathol,2008,21(6):691-699.

[7]Whang YM,Kim YH,Kim JS et al.RASSF1A suppresses the c-Jun-NH2-kinase pathway and inhibits cell cycle progression[J].Cancer Res,2005 May 1;65(9):3682-3690.

[8]Yoo YA,Na AR,Lee MS,et al.RASSF1A suppresses oneogenic H-Ras-induced c-Jun N一tenninal kinase activation[J].Int J Oneol,2006,29(6):1541-1547.

[9]Thaler S,Hhnel PS,Schad A,et al.RASSF1A mediates p21Cip1/Waf1-dependent cell cycle arrest and senescence through modulation of the Raf-MEKERK pathway and inhibition of Akt[J].Cancer Res,2009,69(5):1748-1757.

[10]Creasy CL,Ambrose DM,Chernoff J. The Ste20-like protein kinase,Mst1,dimerizes and contains an inhibitory domain[J].J Biol Chem,1996,271:21049-53.

[11]Oh HJ,Lee KK,Song SJ,et al.Role of the tumor suppressor RASSF1A in Mst1-mediated apoptosis[J].Cancer Res,2006,66(5):2562-2569.

[12]Guo C,Tommasi S,Liu L,et al.RASSF1A is part of a complex similar to the Drosophila Hippo/Salvador/Lats tumor-suppressor network[J].Curr Biol,2007,17(8):700-705.

[13]Rabizadeh S,Xavier RJ,Ishiguro K,et al.The scaffold protein CNK1 interacts with the tumor suppressor RASSF1A and augments RASSF1A-induced cell death[J].J Biol Chem,2004,279(28):29247-29254.

[14]Baksh S,Tommasi S,Fenton S,et al.The tumor suppressor RASSF1A and MAP-1 link death receptor signaling to Bax conformational change and cell death[J].Mol Cell.2005,18(6):637-650.

[15]Vos MD,Dallol A,Eckfeld K,et al.The RASSF1A tumor suppressor activates Bax via MOAP-1[J].J Biol Chem,2006,281(8):4557-4563.

[16]Foley CJ,Freedman H,Choo SL,et al.Dynamics of RASSF1A/MOAP-1 Association with Death Receptors[J].Mol Cell Biol,2008,28(14): 4520-4535.

[17]Whitehurst AW,Ram R,Shivakumar L,et al.The RASSF1A tumor suppressor restrains anaphase-promoting complex/cyclosome activity during the G1/S phase transition to promote cell cycle progression in human epithelial cells[J].Mol Cell Biol,2008,28(10):3190-3197.

[18]Song MS,Song SJ,Ayad NG,et al.The tumor suppressor RASSF1A regulates mitosis by inhibiting the APC-Cdc20 complex[J].Nat Cell Biol,2004,6(2):129-137.

[19]Song SJ,Song MS, Kim SJ,et al.Aurora A regulates prometaphase progression by inhibiting the ability of RASSF1A to suppress APC-Cdc20 activity[J].Cancer Res,2009,69(6):2314-2323.

[20]Levitt NC,Hickson ID.Caretaker tumour suppressor genes that defend genome integrity[J].Trends Mol Med,2002,8(4):179-186.

[21]Shiloh,Y.ATM and related protein kinases:safeguarding genome integrity[J].Nat Rev Cancer.2003,3(3):155-168.