白細胞介素-10對腦梗死再灌注大鼠p53AIP1蛋白表達的影響

李科，劉健，任紅英，蔣鑫

腦卒中是臨床常見的神經系統急癥之一，以高病死率、高致殘率為主要特點，搶救生命與腦功能的保護是治療重點，可是到目前為止，治療這類患者的手段還是乏善可陳。近幾年，隨著對腦卒中病理生理研究的進展，人們研究的焦點逐漸集中于如何減少腦卒中患者繼發炎癥反應致腦神經細胞凋亡。白細胞介素-10（IL-10）是目前研究較多的一種抗炎因子，目前認為 IL-10 能通過抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和其他前炎性細胞因子的產生減輕缺血后腦損傷，有利于神經元的修復和存活，在腦缺血中有神經保護作用[1]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

36 只 6～8 周成年 SD 雄鼠，清潔級，體重200～250 g，實驗動物由嶺南實驗動物中心提供。兔抗大鼠 p53AIP1 抗體為英國 Abcam 公司產品；羊抗兔 HRG 標記二抗為美國 SANTA Crus公司產品；重組大鼠白細胞介素-10（rrIL-10）為英國 Peprotech EC 公司產品；總蛋白提取試劑盒為北京普利萊公司產品；Tunel 法凋亡檢測試劑盒為美國默克公司產品（目錄號：QIA39）；SDS-PAGE膠配制試劑盒為北京碧云天公司產品；HRP 標記的GAPDH 內參抗體為上海康成生物工程有限公司產品；26 號尼龍線栓為北京沙東生物技術有限公司產品；濃縮多聚賴氨酸為廣州威佳公司產品。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦梗死再灌注模型的構建 36 只大鼠隨機抽取 6 只作為假手術組，其余 30 只為手術組。大鼠禁食 12 h 與禁水 6 h 后，氯胺酮100 mg/kg 大鼠肌肉注射麻醉。采用改良 MCAO（middle cerebral artery occlusion）法[2]，將預先經多聚賴氨酸浸漬，60 ℃ 烘干處理過的直徑為 0.26 mm的線栓經大鼠右側頸內動脈（carotid artery，CA）置入約 18～22 mm（根據動物大小調整插入線栓的深度），阻塞右側大腦中動脈，記錄梗阻開始時間，固定外端的線栓并標記留在皮膚外面線栓的長度，縫合皮膚。大鼠麻醉未蘇醒時注意保暖。缺血 2 h后，拔出線栓約 10 mm，使線栓退至頸總動脈杈處，實現腦缺血再灌注。

1.2.2 動物模型評分 動物模型評分標準（Zea longa評分標準）[2]如下：

0 分：無神經缺損癥狀，活動正常；

1 分：不能完全伸展對側前肢（輕度局灶性神經功能缺損）；

2 分：行走時身體向偏癱側轉圈（中度局灶性神經功能缺損）；

3 分：行走時向偏癱側傾倒（重度局灶性神經功能缺損）；

4 分：不能自發行走，意識喪失。

評分 1～3 分即符合本實驗要求，否則另選大鼠再行手術補足手術組，符合要求的大鼠隨機分為2組，一組經尾靜脈給予 rrIL-10（稱為 IL-10組），按照藥物/大鼠 = 10 mg/kg 的比例經鼠尾靜脈泵入濃度 20 mg/L 的 IL-10，速度為 15 μg/h；另 1組不做任何干預，為對照組。假手術組：除不插線栓外，其余操作與對照組相同。

1.2.3 大鼠分組 各組內大鼠分別按照術后 24、48 和72 h 隨機分為 3 個亞組，于相應時間點處死，快速斷頭取右側大腦；沿視交叉處冠狀切開，向枕部方向切取約 2 mm 厚腦組織，液氮快速冷凍，–70 ℃ 冷藏備用。

1.2.3.1 石蠟切片與 HE 染色 樣本常規中性甲醛固定過夜-梯度酒精、二甲苯脫水-浸蠟-包埋-切片（厚度3 μm）-HE染色-光鏡觀察。

1.2.3.2 冰凍切片與 Tunel 染色 樣本規冰凍切片機切片，厚度 5 μm 冰凍切片應用 Tunel 染色試劑盒染色，程序嚴格按照試劑盒要求進行；防熒光淬滅封片，熒光顯微鏡（485/535 nm）觀察。

1.2.4 p53AIP1 蛋白表達的測定

1.2.4.1 蛋白樣品制備 蛋白提取采用北京普利來公司的總蛋白試劑盒，嚴格按照說明書進行。每100 mg 腦組織提取的總蛋白溶解在 1 ml 2.5%SDS 溶液中備用。

1.2.4.2 SDS-PAGE 電泳 北京普利來公司生產的配膠試劑盒 12% 分離膠、5% 濃縮膠，100 V 恒壓電泳 2 h，170 mA 恒流濕式電轉 PVDF 膜 2 h；1xTBST 洗膜 3 次；5% 脫脂奶粉溶液封閉 2 h，1∶1000 一抗孵育 4 ℃ 過夜，1xTBST 洗膜 3 次；1∶2000 二抗孵育 2 h，1xTBST 洗膜 3 次；北京普利來公司電致化學（ECL）發光液發光處理，X 線曝光檢查蛋白條帶；GAPDH 內參實驗過程同上。

凝膠成像結果使用 Gelpro Analyzer 4 軟件分析蛋白條帶光密度值，數據引入 EXCEL。數據采用 SPSS13.0 進行統計學分析。統計學處理所得數據采用的比較采用單因素定量資料的方差

1.3 統計學處理

分析。方差齊，組間多重比較采用 LSD 分析，方差不齊，組間多重比較采用 Dunnett’s T3 分析；以P ＜ 0.05 認為差異有統計學意義。多個總體均數的兩兩比較采用 q 檢驗，以 P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組動物模型評分情況（見表 1）

表1 各組動物評分結果Table 1 Score results in each group

2.2 石蠟切片、HE 染色

觀察可見對照組梗死區細胞稀少，廣泛的神經元壞死，細胞溶解伴軟化灶形成；細胞結構模糊，細胞體縮小變形，染色加深，核消失，血管可見粒細胞附壁及浸潤；細胞及組織間隙水腫，梗死灶周圍可見“氣球樣改變”和間質水腫，水腫以皮層下結構及梗死區向非梗死區的移行區為重。IL-10組相對較輕。假手術組則無上述病理改變（圖 1）。

2.3 冰凍切片、Tunel 染色

Tunel 免疫熒光顯微鏡不同波長（485/535 nm）觀察也可見到無論哪個時間段，IL-10組細胞凋亡情況均較對照組輕；假手術組極少見凋亡細胞（圖 2）。

2.4 p53AIP1 蛋白表達情況

圖1 各組大鼠不同處死時間的石蠟切片 HE 染色結果（A：假手術組 24 h；B：對照組 24 h；C：白細胞介素-10組 24 h；D：假手術組 48 h；E：對照組 48 h；F：白細胞介素-10組 48 h；G：假手術組 72 h；H：對照組 72 h；I：白細胞介素-1072 h）Figure 1 The HE staining of paraffin section at all time piont of treatment groups.A: Sham group after 24 h; B: Control group after 24 h; C: IL-10 group after 24 h; D: Sham group after 48 h; E: Control group after 48 h; F: IL-10 group after 48 h; G: Sham group after 72 h; H: Control group after 72 h; I: IL-10 group after 72 h.

圖2 各組大鼠不同處死時間的 Tunel 染色冰凍切片免疫熒光（485/535 nm）（A：假手術組 24 h；B：對照組 24 h；C：白細胞介素-10組 24 h；D：假手術組 48 h；E：對照組 48 h；F：白細胞介素-10組 48 h；G：假手術組 72 h；H：對照組 72 h；I：白細胞介素-1072 h）Figure 2 The Tunel staining of frozen sections with immunofluorescence at all time piont of treatment groups.A: Sham group after 24 h; B: Control group after 24 h; C: IL-10 group after 24 h; D: Sham group after 48 h; E: Control group after 48 h; F: IL-10 group after 48 h; G: Sham group after 72 h; H: Control group after 72 h; I: IL-10 group after 72 h.

假手術組 p53AIP1 蛋白表達各時間點均為弱陽性[正常腦組織里有微量的凋亡細胞存在，可產生微量的凋亡蛋白。光密度比值（IOD ratio）≤0.05]，手術組各時間點的 p53AIP1 蛋白表達均為陽性光[密度比值（IOD ratio）＞ 0.05]；手術組與假手術組各時間點 p53AIP1 蛋白表達均有統計學意義（各時間點 P ＜ 0.01），且手術組中的 IL-10組和對照組各時間點 p53AIP1 蛋白表達均有統計學意義（各時間點 P ＜ 0.01）。結果見圖 3 和4。

圖3 蛋白質印跡檢測 p53AIP1 蛋白表達（A：白細胞介素-10組；B：對照組；C：假手術組）Figure 3 The expression of protein p53AIP1 was detected by Western blotting.A: IL-10 group; B: Control; C: Sham group.

圖4 p53AIP1蛋白光密度值Figure 4 The IOD ratio of p53AIP1

3 討論

腦缺血一定時間恢復血液供應后，其功能不但未能恢復，卻出現了更加嚴重的腦功能障礙，稱之為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIR）。腦缺血再灌注損傷目前認為可能與自由基的生成、細胞內鈣超載、興奮性氨基酸毒性、白細胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有關。急性局灶性腦缺血引起的缺血中心區死亡以細胞壞死為主，缺血中心區與正常腦組織之間的所謂半暗帶區域內的神經元細胞于再灌注后出現了遲發性神經元死亡（delayed neuronal death，DND），此DND 表現為細胞凋亡（programmed cell death，PCD），確切機制目前仍不完全清楚，尚需進一步深入研究。而搶救這些 DND 神經元、減少神經元的凋亡正是臨床上的治療重點之一。

p53 調節的凋亡誘導蛋白 1（p53-regulated apoptosis-inducing protein l，p53AIP1）基因是2000年由日本東大醫科學研究所中村佑輔教授[3]帶領的研究小組首先發現的，其研究歷史短暫；目前認為它是p53 下游的一個促凋亡基因，其表達受野生型 p53 的調控誘導，在 p53 依賴性的凋亡調控通路中起重要作用。在 p53AI P1 介導的線粒體凋亡途徑中，p53AIP1 作為 BH3-only 樣蛋白，轉位于線粒體后激活 Bax[4]。Bax 在線粒體膜上寡聚化，形成一個跨膜通道，導致線粒體內外膜之間的電勢能降低，細胞色素 C 釋放，啟動細胞凋亡途徑。在 p53 依賴性的促凋亡調控通路中，p53AIP1 通過調節線粒體膜電化學梯度的方式介導細胞凋亡。而其在體內的具體促凋亡機制目前仍不清楚。

IL-10 于 1989 年由 Dnax 研究所[5]首次在小鼠的 TH2 細胞培養上清中發現，1990 年，Moore將其命名為 IL-10[6-7]。IL-10 具有廣泛的生物學活性，在機體中主要起著免疫調節（免疫抑制及免疫刺激）和抗炎癥兩大作用。Dietrich 等[8]在全腦缺血小鼠海馬定量病理組織學分析中發現，聯合應用IL-10 較單純應用低溫療法更能提高神經元存活率。在外傷性腦損傷，靜脈或皮下給予 IL-10，能提高神經元的修復和存活能力。Van Exel 等通過對倫敦 599 名 85 歲以上老人血清 IL-10 水平分析后，發現低 IL-10 水平人群發生中風的危險性較高，指出抗炎因子 IL-10 在缺血性腦血管病中起著重要的保護作用[1,9]。Clarkson 等[10]發現，去除IL-10 的小鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）后腦梗死的面積較正常野生型小鼠大 30%，在體外，其大腦皮質細胞培養物對興奮性神經毒性的敏感性增加，對缺血缺氧耐受性較野生型小鼠差，而將重組IL-10 加入培養液后，則可減輕興奮性神經毒性和缺血缺氧造成的損傷，結果說明外源性及內源性IL-10 在腦缺血時都具有神經保護作用。以上研究證明，對于腦損傷，應用 IL-10 治療可明顯減弱炎癥反應，產生重要的抗炎保護作用。

但目前對于 IL-10 的神經保護作用機制尚不十分了解，推測IL-10 在急性腦缺血后抑制炎性反應的機制，主要通過以下 3 個途徑：①減少 γ 干擾素（IFN-γ）、白細胞介素-1（IL-1）和TNF-α 等前炎性細胞因子的合成[11-12]；②抑制炎性細胞因子受體表達；③降低炎性細胞因子活性[13]。IL-10 的抗炎保護作用始終與TNF-α水平降低有關，國外很多文獻在全身性疾病研究中有所報道[14-15]。IL-10能對多種類型細胞發揮免疫抑制和免疫激勵效力，在中樞神經系統具有神經保護和神經營養作用，是一種與腦缺血損傷和損傷修復過程相關的重要抗炎細胞因子。

本實驗在觀察 MCAO 大鼠應用 IL-10 與細胞凋亡的關系中，發現應用 IL-10 后無論哪個時間段，MCAO 大鼠腦組織細胞凋亡情況均明顯低于對照組（P ＜ 0.01）。

本實驗在研究中發現，腦組織 p53AIP1 蛋白在腦梗死再灌注后含量是呈動態變化的。發病 24 h測得 p53AIP1 蛋白顯著增高，48 h達高峰，隨后逐漸下降，但發病第 3 天對照組仍顯著高于 IL-10組。

總之，我們認為腦缺血急性期的機體免疫系統處于激活狀態，p53AIP1 蛋白在神經元細胞損傷凋亡過程中扮演了一定角色，但具體情況尚缺乏足夠的研究；IL-10 是一種與腦缺血損傷和損傷修復過程相關的重要抗炎細胞因子，具有神經保護和神經營養作用。通過本實驗，我們可以確定 IL-10 對p53AIP1 蛋白的表達具有一定的抑制作用，其機制尚待進一步的研究；為將來 IL-10 應用于臨床積累經驗。

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