黃芪注射液對心肌細胞氧化應激性損傷的保護作用

關鳳英,李紅,于秀霞,楊世杰

中藥黃芪為豆科植物膜莢黃芪(Astragalus membranaceus Bge)和蒙古黃芪(Astragalus membranaceus Bge.Var.monhokicus(Bge)Hasiao)的干燥根。其味甘、性溫,有補氣升陽、固表止汗、托毒排膿、利水消腫和生肌等功效,為補氣要藥。其作用非常廣泛,對多種疾病尤其是心血管疾病,如缺血缺氧心肌具有確切的保護作用。它的藥理作用機制大多是綜合性的,主要涉及到心肌代謝的改善、自由基的清除、Na+-K+-ATPase活性的抑制等方面,但對其確切的保護機制缺乏深入研究。本實驗在離體細胞水平就黃芪注射液(Astragalus injection,AI)預適應作用保護機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 1 d齡新生清潔級Wistar大鼠乳鼠:吉林大學基礎醫學院實驗動物中心。四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MT T):SIGMA公司;黃芪注射液(每支10 ml,相當于原生藥20 g,批號:Z51021776):成都地奧九泓制藥廠;小牛血清:杭州四季青公司;高糖Dulbecco最低必需培養液(IMDM):Hyclone公司;胰酶:DIFICO公司;乳酸脫氫酶(lac-tate dehydrogenase,LDH)及一氧化氮(nitric oxide,NO)檢測試劑盒:南京建成生物工程研究所。胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)熒光探針DCFH、內皮型一氧化氮合成酶抑制劑(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)、羅 丹 明-123(Rhodamine123,Rh123):SIGMA公司;細胞凋亡AnnixinV/FITC/PI雙染試劑盒:晶美。酶標儀:成都泰盟儀器有限公司;GF-200半自動生化測定儀:山東高密彩虹儀器有限公司;6010-紫外分光光度計:安揭倫上海分析儀器廠生產。

1.2 細胞培養及分組 取出生1 d Wistar大鼠乳鼠,在其劍突下剪開十字切口,取下心臟;磷酸緩沖液(PBS)沖洗后,將心肌組織剪碎,經0.1%胰酶消化;收集消化后的懸液,加入含10%胎牛血清IMDM,1500 r/min離心10 min,棄去上清,以含10%胎牛血清 IMDM懸浮,接種于10 cm培養瓶中;用差速貼壁法于CO2孵箱中培養90 min。加入成纖維細胞抑制劑5-溴脫氧脲苷100 μ mol/L,記數后以2×105/L密度再次接種于孔板或培養瓶中,待心肌細胞呈半融合狀態后換為不含血清的IMDM培養液,同步化12 h后進行實驗。

實驗分為:①對照組(Control):心肌細胞不做任何處理;②模型組(Model):加入過氧化氫(hydrogen peroside,H2O2)0.15 mmol/L制備氧化損傷模型;③黃芪注射液高、中、低劑量組(AI,90 g/L、30 g/L和10 g/L):AI+Model;④L-NAME干預組:AI(90 g/L)+Model+L-NAME(20 μ g/L)。 ③、④組心肌細胞加入各種藥后孵育30 min,再加入H2O2損傷5 h。

1.3 MT T法測定細胞存活力 與實驗孔平行設不加細胞只加培養液的空白對照孔,比色時以空白孔調零。心肌細胞存活力以酶標儀490 nm處(A)值表示。

1.4 培養基中LDH、NO含量測定 取心肌細胞培養上清200 μL,檢測LDH 和NO含量,按照試劑盒說明進行操作。

1.5 ROS生成量 加入H2O2后 30 min,每組3復孔,將處理過的心肌細胞棄去培養基,用Hepes液洗3次。加入 DCFH 10 μ mol/L負載液,避光孵育 30 min,棄去負載液;Hepes液洗3次后,重新添加Hepes液200 μL。將負載好的細胞放在激光共聚焦顯微鏡下,設定參數,在波長485 nm處激發,發射波長530 nm,掃描細胞(1次/s),記錄 ROS熒光強度。

1.6 心肌細胞線粒體膜電位(ΔΨ m) 心肌細胞以2×105/L密度接種于24孔板,同上實驗分為4組,每組3復孔。將處理過的心肌細胞棄去培養基,加入0.25%胰酶消化后收集到1.5 ml的Effindoff管中,用PBS洗3次。加入5 mg/L Rh123負載液50 μL,避光孵育10 min,棄去負載液,PBS洗3次,用EILITE型流式細胞儀檢測熒光強度變化。

1.7 細胞凋亡率 分組同前。原代培養心肌細胞以1×106/L接種于100 ml培養瓶,0.25%胰蛋白酶消化,PBS 洗滌 2次,加入200 μL結合緩沖液懸起,取 100 μL細胞懸液于5 ml流式管中,加入5 μL annixinV/FITC和 20 μ g/ml碘化丙啶(propidium iodide,PI)10 μL,混勻后室溫避光孵育 15 min,在反應管中加PBS 400 μL,以正常對照組設定檢測參數,用EILITE型流式細胞儀檢測,光源為488 nm氬離子激光器,FITC受激發后發綠色熒光,PI發紅色熒光。每個樣本至少收集10000個細胞,流式細胞儀分析,獲得四個象限組成的細胞直方圖,每個象限的細胞數就是檢測細胞總數所在點的組分。左下象限代表正常細胞(An-PI-),右下象限代表早期凋亡細胞(An+PI-),右上象限代表晚期凋亡細胞和壞死細胞(An+PI+),左上象限代表細胞收集過程中出現的損傷細胞(An-PI+)。

1.8 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件處理數據,數據以(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 心肌細胞存活力 模型組心肌細胞存活力較對照組明顯下降(P＜0.01),各劑量AI組心肌細胞存活力較模型組顯著增高(P＜0.05),其中高劑量組效果最好,見表1。故以下實驗均只選用高劑量組數據。

表1 乳鼠心肌細胞生存能力比較(n=6)

2.2 L-NAME對黃芪注射液保護作用的干預 模型組心肌細胞存活力較對照組明顯下降(P＜0.01),培養上清中LDH活性增高(P＜0.05),NO含量略有升高,但無顯著性差異,ROS明顯升高(P＜0.01),ΔΨ m明顯下降(P＜0.01),細胞凋亡率明顯上升(P＜0.01);AI組心肌細胞存活力較模型組明顯增高(P＜0.01),LDH活性明顯降低(P＜0.01),NO活性明顯增高(P＜0.01),ROS明顯降低(P＜0.01),ΔΨ m 明顯上升(P＜0.01),細胞凋亡率明顯下降(P＜0.01);L-NAME組心肌細胞存活力較AI組下降(P＜0.05),LDH活性明顯增高(P＜0.01),NO含量下降(P＜0.05),ROS降低幅度減弱(P＜0.05),ΔΨ m下降(P＜0.05),細胞凋亡率上升(P＜0.05)。見表2。

表2 各組乳鼠心肌細胞實驗指標比較(n=6)

3 討論

心肌細胞受外來因素的影響會發生氧化狀態的改變,即胞內ROS升高。ROS是生物體有氧代謝產生的一類活性含氧化合物的總稱,包括超氧陰離子、羥自由基與高活性的單線態氧、過氧化氫等。過量的ROS可引起細胞大分子的氧化損傷。H2O2是體內氧化代謝的中間產物之一,也是ROS的重要組成部分,大量積聚時會對細胞產生毒性作用,濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內,細胞毒性呈劑量依賴關系[1]。本實驗采用H2O2損傷心肌細胞來模擬體內氧化應激這一許多心血管疾病共同的病理生理過程,具有細胞損傷形態學明顯,損傷可被藥物對抗,模型穩定的特點。實驗結果顯示,采用0.15 mmol/L制備的損傷模型無論從心肌細胞存活力、LDH漏出量還是細胞凋亡率方面都顯示出心肌氧化應激損傷的模型成立。

本實驗首先考察了不同濃度AI對H2O2損傷心肌細胞的保護作用,結果顯示各濃度AI對受損心肌細胞均具有保護作用,其中高劑量組(90 g/L)效果最好。故隨后的機制研究實驗均選用高劑量組。本實驗研究證實,與模型組比較,AI預處理則可以誘導NO的生成,ROS顯著降低、線粒體膜電位升高及細胞凋亡率下降,說明AI預處理后可減少活性氧的生成,降低細胞受損程度。

NO可由多種細胞產生,具有廣泛的生理功能。NO和H2O2都是可跨膜的物質,在許多情況下,NO和H2O2信號之間相互聯系。植物學研究顯示,NO是ROS的清除劑,NO可通過影響過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和抗壞血酸過氧化物酶(ASAPOD)的活性調節內源性H2O2含量。NO能夠顯著誘導鹽脅迫下小麥葉 SOD和 CAT活力的上升,延緩O2-和H2O2積累,同時促進抗氧化物質脯氨酸的含量上升,從而減輕鹽脅迫下小麥葉片的氧化損傷[2]。已有大量研究證明,NO與缺血預適應作用有關[3-4]。我們在實驗中發現,AI能夠誘導NO生成,從而推測AI可能通過NO的生成產生保護作用。

NO由一氧化氮合酶(oxide synthase,NOS)催化左旋精氨酸生成。迄今為止,已知至少有3種NOS參與NO的生物合成:內皮型(eNOS)、誘導型(iNOS)和神經元型(nNOS)。eNOS位于內皮細胞的細胞膜上,也存在于心肌細胞上[5-6],基礎活性較低;某些生理活性物質與內皮細胞膜上的相應受體結合后,動員細胞Ca2+,引起eNOS活化,觸發一系列生物事件,如mitoKATP通道開放等[7-8],發揮保護作用。當AI與eNOS抑制劑 L-NAME共孵育后我們發現,L-NAME降低了AI對受損心肌細胞的保護程度。NOS是NO合成的限速酶,由于NOS活力水平的下降引起NO合成減少,綜合分析可推測AI的心肌細胞保護作用可能與促進eNOS生成NO有關。NO是預適應保護作用中最重要的觸發因子,故而其誘導的保護作用可啟動一系列信號的傳導,最終誘導保護性蛋白,從而抑制心肌細胞凋亡,穩定線粒體膜電位,發揮保護作用。其具體下游事件的發生尚有待系統研究。

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