小鼠放射性肺損傷動物模型的建立與鑒定*

周 芊，王 東，李夢俠，曾林立，王 閣，楊鎮洲

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所腫瘤中心，重慶 400042)

放療是胸部腫瘤最主要的治療手段之一，而放射性肺炎(radiation pneumonitis，RP)作為胸部腫瘤放療常見的嚴重并發癥和劑量限制因素，其發生率達5%～15%，一旦發生，通常引起嚴重的臨床后果[1]。因此，對放射性肺損傷病理過程及發生機制的研究越來越受到各國學者的重視，建立一種合適的放射性肺炎動物模型以及穩定、準確的鑒定方法是進一步深入研究所必須的。為此，本研究建立了放射性肺損傷小鼠動物模型，并對模型進行了病理組織學和血清學鑒定，為今后研究放射性肺損傷防護提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 體質量17～21 g成年健康雌性昆明小鼠72只，購自第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心。數字化直線加速器(瑞典ELEKTA公司)、普通光學顯微鏡(BX-50，Olympus，日本)、蛋白核酸分析儀(美國Bio-Rad公司)、5804型臺式冷凍離心機(德國 Eppendorf)、PROTEAN Ⅱ中型垂直電泳儀(美國 Bio-Rad公司)、TGF-β1小鼠單抗試劑盒(美國 Biosource)等。

1.2 全胸照射方法 速眠新Ⅱ(1.5 mg/kg)肌肉注射，全身麻醉小鼠，將小鼠仰臥位固定于治療床上，以5 mm鉛板防護動物頭部和腹部。照射組小鼠使用直線加速器產生的8 m V X射線，經前胸野單次照射小鼠肺臟中平面 20 Gy，劑量率為200 cGy/min，動物與放射源距離為100 cm，射野范圍為10 cm×10 cm。對照組小鼠給予麻醉后佯裝照射。

1.3 鼠肺大體標本觀察 于照射后1、3 d和1、2、4、8周6個時相點麻醉小鼠，先結扎氣管再剖開胸腔分離主氣管，并快速將氣管及雙肺剝離出胸腔，觀察肺的大體結構改變。

1.4 組織病理學觀察 選取小鼠右肺組織予10%甲醛固定，常規石蠟包埋切片，作HE染色和利用M asson三聯染色(肺組織膠原纖維染色)評價肺組織切片纖維化程度，光鏡觀察病理組織結構改變。

1.5 酶聯免疫(ELISA)法檢測 于照射后1、3 d和1、2、4、8周6個時相點，每組取3只小鼠眼靜脈血1.5～2 m L，25℃下放置30 min，4000 r/min離心5 min，取血清0.5 m L置于1.5 m L聚丙二醇試管內，血清轉化生長因子(TGF-β1)含量測定按說明書進行操作。用包被緩沖液稀釋兔抗鼠IgG單克隆抗體包被酶標板，稀釋度分別為1∶5000、1∶10000、1∶20000、1∶40000，每一濃度包被 3個縱行，每孔100μL，4 ℃過夜，每孔均作復孔。次日，將酶標板洗滌3次，5%BSA封閉，每孔200μL，37℃孵育2 h，洗滌3次。在橫行包被孔中依次加入陰性對照血清，弱陽性抗原液及強陽性抗原液，每孔100μL，37℃孵育1 h，洗滌3次。在每一包被濃度的一個縱行中分別加入按1∶2000、1∶5000、1∶10000稀釋的上述多克隆抗體，每孔100μL，37℃孵育1 h，洗滌3次。在每一包被濃度的一個縱行中分別加入按1∶5000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG抗體，每孔 100μL，37℃孵育45 min，洗滌3次。加 TMB底物，室溫避光顯色 15～20 min，用2 mol/L H2SO4終止反應，讀取OD450值。以OD值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。根據血清樣品的OD值在標準曲線上查出其濃度。

2 結 果

2.1 大體觀察 小鼠全肺照射后4周，照射野內被毛明顯脫落。解剖標本顯示:對照組小鼠肺臟外觀呈粉紅色，表面光滑，彈性良好;照射組肺臟輕度腫脹、充血，表面和切面可見散在出血點，照射后8周全肺呈暗紅色。

圖1 小鼠肺照射后組織形態學改變(HE×400)

圖2 小鼠肺組織Masson三聯染色顯示肺組織受照射后膠原纖維的變化(M asson×400)

2.2 HE染色和Masson染色組織學觀察 對照組小鼠肺組織結構正常，肺間質未見充血，毛細血管壁完整，肺泡及細支氣管腔無炎性滲出，見圖1A。而照射組小鼠肺組織照射后1、3、7、14 d病變以滲出為主，肺間質及肺毛細血管充血、水腫，肺泡腔及細支氣管內見較多的淋巴細胞，間質水腫致肺泡壁輕度增厚，部分肺泡間含水腫液，見圖1B。照射后4、8周病變以慢性炎癥為主，支氣管和血管周圍可見以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，肺泡壁增厚，肺泡腔變小，肺泡間隔及部分肺泡腔內可見纖維素樣滲出物，見圖1C。Masson三聯染色:可見肺間質藍色膠原纖維沉積，對照組可見少許纖維組織，見圖2A;照射組照射后2周纖維組織開始增生，見圖2B，照射后4、8周肺纖維化形成，肺結構紊亂，并可見大量染成綠色的膠原纖維，見圖2C、D。

2.3 血清 TGF-β1檢測結果 照射后 1周血清 TGF-β1含量明顯增高，此后逐漸增高，第8周達高峰，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，見圖 3。

圖3 各組小鼠血清TGF-β1含量檢測

3 討 論

放射性肺損傷動物模型建立對進一步研究放射性肺損傷機制及防治至關重要。綜合遺傳背景、操作難易程度、費用等因素，由于小鼠體積小、成本低，易于建立并方便快捷，目前認為建立放射性肺損傷鼠類動物模型比較適合且應用最為廣泛。本研究應用昆明小鼠建立了放射性肺損傷模型，該小鼠特點是抗病力和適應力強、成活率高。

放射性肺損傷與照射劑量、受照體積和部位等因素相關，研究者可根據研究目的來選擇照射劑量。進行放射肺損傷的長期效應研究，國外有學者給予4 Gy或7 Gy單次照射小鼠肺組織，應用呼吸頻率和致死率來評價1年后放射性肺損傷，也有研究者采用13.5 Gy單次照射小鼠并持續觀察24周[1-2]。楊明會等[3]報道對比大鼠一次性給予30 Gy或3 Gy、每周2次、總劑量30 Gy的照射，組織學證實兩組均能引發典型的放射性肺炎和肺纖維化，但26周后發現小劑量多次照射組大鼠存活率高。對放射肺損傷進行短期研究，目前多采用大分割單次照射法。孟玲玲等[4]采用6 m V X線單次照射小鼠右肺30 Gy，觀察至照射后2個月。雖然小劑量多次照射被認為更符合臨床常規治療劑量，但目前大家也逐步開始關注全身立體定向治療時的大分割照射，故在本實驗中仍采用20 Gy全肺單次照射構建放射性肺炎模型。本研究結果表明，通過全肺20 Gy單次照射雌性昆明小鼠，成功地復制出典型的放射性肺炎小鼠動物模型。

國內外學者研究認為放射性肺損傷的病理形態學改變主要是肺間質充血水腫，肺泡內滲出物增加，炎細胞浸潤，后期纖維結締組織增生，肺泡萎縮[5-6]。本研究結果基本與之相符，照射組2周內以滲出為主，4周后病變以慢性炎癥為主，肺泡間隔及部分肺泡腔內可見纖維素樣的滲出物。因而，通過病理觀察證實本放射性肺炎小鼠模型成功建立。目前比較認同的放射性肺損傷發生的機制為放療產生的活性氧直接作用于實質細胞并通過改變細胞因子的微環境而啟動一系列的“分子級聯”反應，隨著活性氧自由基的增多，導致脂質過氧化、DNA和蛋白質的氧化以及致炎因子的進一步激活，最終導致纖維化形成[7-8]。國內外學者對這些生物因子進行了大量研究，目前比較一致的觀點認為血清TGF-β1水平可以作為放射性肺損傷的預測因子，與急性放射性肺炎尤其是放射性纖維化密切相關。本實驗發現放療后小鼠血清TGF-β1含量呈現逐漸升高過程，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，這與Machtay等[2]研究結果類似，只是在發生改變所對應的時相點和含量的高低上有所差別。

[1]T ravis EL，De Luca AM.Protection of mouse lung by WR-2721 after fractionated doses of irradiation[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，1985，11(3):521.

[2]Machtay M ，Scherpereel A ，Santiago J，et al.Systemic polyethylene glycol-modified(PEGylated)superoxide dismutase and catalase mixture attenuates radiation pulmonary fibrosis in the C57/bl6 mouse[J].Radiother Oncol，2006，81(2):196.

[3]楊明會，張利軍，馮林春，等.小劑量多次照射大鼠放射性肺損傷模型的評價[J].軍醫進修學院學報，2006，27(6):415.

[4]孟玲玲，馮林春，石懷銀，等.苦參堿防治放射性肺損傷的實驗觀察[J].軍醫進修學院學報，2008，29(2):134.

[5]Szabo S，Ghosh SN ，Fish BL ，et al.Cellular inflammatory infiltrate in pneumonitis induced by a single moderate dose of thoracic x radiation in rats[J].Radiat Res，2010，173(4):545.

[6]Kiazimov KI.Pathogenesis，diagnostics and treatment of radiation pneumonitis induced by radiotherapy of lung cancer[J].Georgian Med New s，2009，174:115.

[7]Ghafoori P，Marks LB，Vujaskovic Z，et al.Radiation-induced lung injury.Assessment，management，and prevention[J].Oncology(Williston Park)，2008 ，22(1):37.

[8]Zhao W，Robbins ME.Inflammation and chronic oxidative stress in radiation-induced late normal tissue injury:therapeutic implications[J].Curr Med Chem，2009，16(2):130.