c-Myc小分子抑制劑10058-F4對腎癌786-0細胞增殖凋亡的影響*

張巧琳，徐 新，劉 琪，羅春麗

(重慶醫科大學檢驗系教育部重點實驗室 400016)

c-Myc是從雞病毒V-myc癌基因和同源物中分離出來的原癌基因，在細胞增殖、凋亡和分化等進程中起重要作用。c-Myc因基因擴增、染色體易位、突變在多種腫瘤中表達失控，參與腫瘤進程[1]。通過微陣列和實時定量PCR發現c-Myc在腎癌中因基因擴增和染色體易位呈高表達，其表達量與患者的預后相關[2]。有學者進一步研究證實，c-Myc通路在腎癌中呈持續活化狀態，體外 RNAi技術沉默c-Myc基因能有效抑制腎癌增殖、凋亡并可調節相應下游分子[3]，但基因沉默對于腫瘤細胞的靶向作用有限。

c-Myc編碼產物為轉錄因子，主要與Max蛋白形成二聚體調節相應下游分子從而調節腫瘤進程。10058-F4是c-Myc小分子抑制劑，可下調c-Myc蛋白表達并特異性阻止c-Myc-Max復合物形成[4-6]。因此，本次實驗預用c-Myc-Max二聚體小分子抑制劑10058-F 4研究其對腎癌786-0細胞增殖和凋亡的作用，探討其潛在治療作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑 786-0細胞株由本室保存，anti-c-Myc、anti-Bcl-2、anti-p27、anti-p21 和 anti-β-actin 的一抗及辣根過氧化物酶標記的抗鼠 IgG均購自 Santa CruZ公司，RPMI1640和小牛血清購自Gibco公司，M TT購自美國Sigma公司，10058-F 4購自Sigma公司。

1.2 細胞培養 人腎細胞癌786-0細胞用含10%新生牛血清的RPM I1640培養液，置于37℃、含CO2體積分數為5%的培養箱中培養，常規換液傳代。

1.3 M TT檢測 取對數期生長的786-0細胞2～5×104個/m L 100μL接種于96孔板，待細胞貼壁后加入圖1A所示濃度的10058-F 4，將其每組細胞做5個復孔，37℃、5%CO2培養箱中孵育，培養不同的時間點后，每孔加入M TT(5 mg/m L)20 μL，繼續培養4 h，棄上清液，每孔加 150μL DMSO，用酶標儀570 nm處測吸光度值。細胞增殖活力按公式計算:細胞生長抑制率=[1-(OD實驗-OD調零)/(OD對照-OD調零)]×100%。

1.4 FCM檢測 取對數生長的786-0細胞接種于50 mL培養瓶中，待細胞貼壁后加入 60、100μM 的10058-F4，加藥后繼續培養細胞24 h，用0.25%胰酶消化，PBS洗 3次，600×g離心5 min，加入70%乙醇固定細胞，1000×g離心10 min去固定液，加入碘化丙啶染色液[1×PBS，0.1%Trton X-100，碘化丙啶(20μg/m L)，RNase A(100μg/m L)]，室溫染色30 min，上流式細胞儀分析細胞周期，采用PI/annexin-V染色用于檢測細胞凋亡，取1×105個細胞加入5μL Annexin V-PE及 10 μL的7-AAD，輕輕混勻，避光保存 20 min，加入 200μL緩沖液，立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5 Western blot法檢測 細胞用預冷的 PBS洗3次，用細胞刮收集細胞于離心管中，800×g離心 5 min，轉移到EP管中，3000×g離心 5 min，加入 RIPA 裂解液，冰上放 30 min，13000×g離心30 min收集上清液，用考馬斯亮藍于酶標儀上測濃度，加入蛋白上樣緩沖液100℃變性5 min，每個上樣孔上相同濃度的蛋白，每孔約 50μg，SDS-PAGE，半干轉于 PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉3 h，一抗 4℃過夜，TBS T洗膜 3次，每次10 min，二抗室溫孵育 1 h，TBST洗膜，3次/10 min，ECL顯色。

1.6 統計學處理 采用S PSS13.0統計軟件進行分析，結果以表示，以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 10058-F 4抑制腎癌細胞786-0增殖及c-Myc蛋白表達MTT檢測結果顯示，加入c-Myc小分子抑制劑10058-F4后，抑制腎癌細胞786-0增殖，且呈濃度依賴性(P＜0.05，圖 1A)和時間依賴性(P＜0.05，圖 1B)，Western blot法檢測結果顯示10058-F 4能明顯抑制c-M yc蛋白水平表達，并呈濃度依賴性(P＜0.05)，見圖1C。

圖1 10058-F4對腎癌786-0細胞增殖及c-Myc蛋白表達的影響

圖2 10058-F 4對腎癌786-0細胞周期和凋亡的影響

圖3 Western blot法檢測10058-F4對腎癌786-0細胞p21、p27和Bcl-2蛋白表達

2.2 10058-F 4阻止786-0細胞周期并誘導凋亡 用流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示，60μM 和 100μM 的 10058-F4均可阻止786-0細胞周期于G0/G1期(P＜0.05)，見圖2A，進一步PI/annexin-V雙染流式檢測顯示，100μM的10058-F4作用786-0細胞24h可誘導細胞凋亡，但作用不明顯，進一步檢測其48 h時細胞凋亡，發現其凋亡細胞增多，對照組細胞凋亡率為(6.2±0.91)%，60μM 的 10058-F4細胞凋亡率為(13.07±0.64)%，100μM 的10058-F4細胞凋亡率為(17.97±0.55)%(P ＜0.05)，見圖2。

2.3 10058-F 4影響p21、p27和 Bcl-2蛋白表達 Western blot法檢測結果顯示，10058-F4可上調p21和p27蛋白表達，并明顯下調Bcl-2蛋白，且呈濃度依賴性(P＜0.05)，見圖3。

3 討 論

c-Myc及其所調節的信號通路在腎癌的發生過程中發揮著重要的作用，抑制 c-Myc表達能有效抑制腎癌生長[3，7]。目前主要采用RNAi技術和寡義核苷酸鏈等抑制c-Myc表達，但這些技術對腫瘤靶向具有局限性。研究發現，c-Myc主要與Max等形成二聚體調節腫瘤惡性生物學行為，小分子抑制劑10058-F4可特異性抑制c-Myc-Max形成。本次研究采用c-Myc小分子抑制劑10058-F4作用于腎癌786-0細胞，發現其能有效抑制腎癌細胞增殖并誘導其凋亡。

c-M yc蛋白屬于具有DNA結合域的轉錄因子，對細胞周期起正向調節作用，c-Myc基因激活導致大量G0期細胞提前進入細胞周期，推動G0/G1期細胞向S期轉變[8]。本研究發現，c-Myc小分子抑制劑 10058-F 4，抑制腎癌 786-0細胞增殖并明顯阻止細胞周期于G0/G1。p21、p27是細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白，通過抑制CDK的激活使細胞周期阻止于G1期，同時 p21、p27是 c-Myc的靶基因[9]。10058-F4可明顯上調p21、p27蛋白表達水平。p21、p27作為c-Myc的靶基因，當c-Myc蛋白水平降低和Max形成二聚體減少，對下游分子的調節作用減弱，p21、p27所受抑制作用相應減弱，表達上調。10058-F4有可能是通過抑制c-Myc活性及與Max二聚體的形成，間接上調 p21、p27蛋白表達，從而抑制腎癌細胞增殖，阻止細胞周期于G0/G1。進一步研究發現，10058-F 4可誘導 786-0細胞凋亡并可下凋c-Myc凋亡相關下游分子Bcl-2蛋白水平，但在24 h時作用并不明顯，隨著時間延長，誘導凋亡作用增加，呈現時間依賴性，這可能是由于細胞內被抑制的目標蛋白有一定的半衰期，只有當目標蛋白降解以后，10058-F4的抑制效應才顯現出來。

c-Myc在多種腫瘤中表達失控，如參與腫瘤的發生，其中包括腎癌，下降c-Myc性活能有效阻止腫瘤進程。c-Myc有望成為腫瘤治療的新靶點，c-Myc小分子抑制劑10058-F4特異性下調c-Myc表達，抑制c-Myc功能二聚體形成，間接有效調節c-Myc靶基因，有望為腎癌治療開辟新途徑。

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