茶氨酸的研究進展

吳春蘭 王 娟 黃亞輝

（華南農業大學園藝學院·廣州·510642）

目前，人們在茶葉中已發現25種氨基酸[1]，茶氨酸 (theanine,γ-glutamylethylamide)被認為是茶葉的特征氨基酸，屬酰胺類化合物，占一般茶葉中游離氨基酸的40%以上，占干茶重的1%～2%[2]。除了茶葉，只在茶梅、山茶、油茶、蘑菇四種天然植物中檢測出其微量存在，其他植物中尚未發現[3]。茶氨酸（N-乙基-r-谷氨酰胺）是1950年日本學者酒戶彌二郎[4]首次從茶葉中提取、精制并確定其化學結構，此后國內外茶葉學者對它進行了較系統的研究。

1 茶氨酸的理化性質

茶氨酸又名谷氨酰乙胺，是谷氨酸的乙胺誘導體，在茶樹根中由谷氨酸和乙胺合成，通過樹干運送到葉中貯藏，在日光照射下可轉化為兒茶素[5]。自然存在的茶氨酸均為L型，純品為白色針狀結晶，熔點217℃～218℃，比旋光度0.7°。 茶氨酸極易溶于水，在茶湯中的泡出率可達80%，其水溶液呈微酸性，不溶于無水乙醇和無水乙醚。茶氨酸的性質較穩定，如將茶氨酸溶液煮沸5min或將茶氨酸溶于pH 3.0的溶液并在25℃下儲放1年，其中的茶氨酸含量不會改變[6]。茶氨酸有焦糖香及類似味精的鮮爽味，能緩解苦澀味，增加茶湯的鮮甜度，其在日本已作為食品添加劑[7]。研究證明茶氨酸的含量與綠茶的品質密切相關，其相關系數為0.787～0.876。經安全性實驗表明茶氨酸安全無毒，在攝取量上沒有任何限制[5]。茶氨酸可經25%硫酸或6mol/L的鹽酸水解為L-谷氨酸和乙胺；用茚三酮顯色成紫色，其發色強度與谷氨酸相似；可用醋酸汞和碳酸鈉沉淀，易與堿或銅生成淡紫色柱狀銅鹽[7]。茶氨酸的定性定量檢測可用堿式碳酸銅沉淀法、強酸性陰離子交換樹脂層析法、茚三酮顯色法、紙層析法、薄層色譜法、氣相色譜法、氨基酸自動分析儀、高效液相及膠束電動氣毛細管色譜法等[8]。

2 茶氨酸的制備

近20年來，茶氨酸的制備得到了茶學、食品、精細化工及醫藥等領域眾多研究者的關注，并且人們企圖通過各種途徑制備和生產茶氨酸。茶氨酸的主要制備途徑有：提取分離法、化學合成法、植物組織細胞培養法和微生物發酵制備法[9]。

2.1 茶氨酸的提取分離法

2.1.1 溶劑沉淀法提取茶氨酸

從茶葉中提取分離茶氨酸是最直接、最有效的生產途徑，也是茶葉深加工和茶葉資源利用領域的重要研究內容。傳統提取分離茶氨酸使用的是試劑沉淀法[10]。用熱水浸提后，分別用氯仿、醋酸鉛除去提取液中的咖啡堿、茶多酚和樹膠類雜質。濾液中加入堿式碳酸銅以析出茶氨酸-銅鹽，再用稀硫酸轉溶，通入硫化氫和加入適量氫氧化鋇，濾除沉淀后即可得到茶氨酸凈化液[11]。但茶葉中僅含有1%～2%的茶氨酸，且容易受硫酸鋇沉淀析出而損失，此外提取純化工藝容易被鉛、銅、硫等離子污染，因此此方法不利于工業化生產。

2.1.2 離子交換法提取茶氨酸

離子交換技術是現行氨基酸工業中應用最為廣泛的提取方法之一。1998年陳瑛等[12]用國產732陽離子交換樹脂從茶愈傷組織浸提液中提取茶氨酸，得率為70%。通過靜態、動態實驗，他們對洗脫液的pH、離子強度、樣液濃度和流速等因素進行考察，比較了在不同條件下樹脂對茶氨酸的吸附情況。2004年，林智、楊勇等[13]人采用絮凝、吸附、陽離子樹脂交換、重結晶工藝來分離純化茶多酚工業廢液中的茶氨酸。結果表明，絮凝能有效去除茶多酚工業廢液中蛋白質等雜質，去除率為50%；吸附能進一步去除多酚類物質、色素及大分子有機物；陽離子交換樹脂能較專一地吸附氨基酸。茶多酚工業廢液經上述工藝可得純度為50%的茶氨酸，得率為1.8%；通過重結晶可得到純度為90%的茶氨酸，得率為0.8%。后來一些研究學者在這些基礎上改進了洗脫工序，用pH7.38的磷酸緩沖鹽為洗脫劑洗脫，減壓濃縮后醇沉，離心上清液濃縮再用體積分數為95%的乙醇結晶，能得到提取率67%，產品純度為99.41%的茶氨酸[14]。對茶葉加工生產廠家來說，這無疑為茶葉綜合利用與開發提供新方向。

2.2 茶氨酸的化學合成法

1942年，以色列人Lichtenstein首次在實驗室中用乙胺和吡咯烷酮在水溶液中反應得到茶氨酸，但產率僅為9%。1961年，Y.Yamda等利用反應物與生成物之間溶解性差異，用L-吡咯烷酮酸先形成銅鹽，再與純乙胺反應合成茶氨酸，大大提高了反應效率。1964年，T.Furuyama等采用二硫化碳保護α-氨基合成茶氨酸。N.Lichtenstein于1965年改用谷氨酸乙醛為原料，用鈀碳催化還原合成茶氨酸，并在以色列申請了專利。1992年，Kawagishi等人又提出了一種用有水乙胺代替無水乙胺，用重結晶法代替層析法合成茶氨酸的新工藝。除此外，茶氨酸的化學合成法還有焦谷氨酸法、N-取代谷氨酸γ-酯法和N-取代谷氨酸酐法。如國內錢紹松等[11]采用N-取代谷氨酸酐法，以L-谷氨酸為原料，用廉價的鄰苯二甲酰基作為保護基，與乙胺反應脫除保護基可得到61%的茶氨酸。盡管采用化學合成法制備茶氨酸具有成本低、操作相對簡單、易于工業化的優點，但可能會殘留毒性物質，生成物還包括D、L-型茶氨酸異構體，需要進行拆分才能得到L型產品。

2.3 茶氨酸的植物組織細胞培養法

利用茶樹細胞和愈傷組織培養也可制備茶氨酸。Orihara等[15]培養茶樹細胞，于B2K瓊脂培養基中加入L-谷氨酸鹽、乙胺和激素，在特定環境中振蕩一段時間后即可獲得茶氨酸。隨后，人們通過改進上述方法，采用茶樹細胞懸浮法合成茶氨酸，結果發現培養體系中茶氨酸的含量可占細胞干重的20%。1990年人們開始陸續報道通過培養茶樹愈傷組織來制備茶氨酸，并進行培養體系的建立、培養條件的篩選等研究。如Marsuura，Drihara等研究了利用茶樹莖尖等外植體培養產生愈傷組織，用愈傷組織生產茶氨酸。其結果表明，在愈傷組織中茶氨酸含量可達20mg/g干重。另有報道，采用組織培養方法，通過系列組織的優化，可使茶葉中茶氨酸的含量從茶葉中的1%～2%提高到愈傷組織中的10%～20%，在這一過程中，激素對茶氨酸產量的影響較大。采用植物組織細胞培養法生產茶氨酸，雖然茶氨酸相對產量較高，并且從培養液中提取茶氨酸相對比較容易，但由于目前運行成本仍過高，暫時還無法產業化。雖然如此，李健等[16]采用褐絨蓋牛肝菌深層發酵來生產茶氨酸，為生產天然茶氨酸提供了一種有希望的新途徑。

2.4 茶氨酸的微生物發酵制備法

近年來，隨著生物技術的發展和應用，利用微生物發酵來生產酶，進而利用酶的提取物來進行目標物的生產越來越被廣泛地應用。用于生產茶氨酸涉及的酶有茶氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺酶、γ-谷氨酰胺轉肽酶等。1965年，經證實在茶苗中含有茶氨酸合成酶，該酶在谷氨酸和乙胺的存在、ATP提供能量的條件下能催化茶氨酸的合成，但此酶極不穩定，合成產率較低，產品純化也很復雜。1986年，Tachiki等[17]報道了從纈氨酸和乙胺通過偶聯baker's真菌和細菌細胞的谷氨酸合成酶來生產茶氨酸，效果不錯，但未能用于連續生產。1993年，Abelian[18]利用硝基還原假單孢細菌（IFO12694）中的固定化谷氨酰胺酶生產茶氨酸，該法已應用于工業化生產。日本太陽化學株式會社發明了兩種制造茶氨酸的新方法，一種是使用來自香茅醇假單孢菌GEA的谷氨酰胺酶作用于谷氨酰胺和乙胺來生產茶氨酸，最高收率可達65%[19]；另一種方法是使用來自芽孢桿菌屬、霉菌或酵母中的1種或2種以上微生物的谷氨酰胺酶作用于谷氨酰胺和乙胺衍生物來生產茶氨酸[20]，該法副產物少且谷氨酰胺的轉化率可達75%，適合工業化生產。2002年，Hideyuki等[21]報道了從大腸桿菌(K-12)中提取γ-谷氨酰胺轉肽酶，將谷氨酰胺和乙胺轉化為茶氨酸，其轉化率達60%，該酶所需反應時間短且不需要ATP參與。2007年Tachiki等人篩選到1株可以生產茶氨酸酶的甲基營養性菌[22]，該酶可以克服對乙胺活力低的缺點，可望進行大規模生產茶氨酸。總之，微生物發酵法生產茶氨酸具有生產成本低、不受資源限制、不會造成環境污染、可大量生產、產品安全可靠等優點，前景非常誘人。

3 茶氨酸的應用

早在1964年日本就將茶氨酸定為食品添加劑使用，用于增強綠茶風味。但由于當時提取的茶氨酸價格非常昂貴，在食品中幾乎無法使用推廣。美國食品和藥物管理局(FDA)在1985年認可了茶氨酸，并確認茶氨酸是一般安全的物質，在使用過程中不作限制用量的規定。1992年日本太陽化學公司研制成功的茶氨酸，價格低廉、純度高且能大規模工廠化生產，使之作為商品可以在食品中添加應用[23]。茶氨酸因具有良好的安全性和穩定性，已在食品如飲料、焙烤點心、冷凍點心等中得到廣泛應用。此外，茶氨酸特殊的性質和生理活性使其在食品和醫藥領域中起著重要作用。

3.1 茶氨酸在醫藥領域的應用

3.1.1 松弛神經緊張和放松作用

茶葉中含有較多具有提神興奮作用的咖啡因，但飲茶后卻不會產生飲入等量咖啡因的興奮作用。對此，人們通過測定試驗大鼠腦波變化實驗來進行研究。木村等和Kimura等分別報道了茶氨酸可以抑制由咖啡因導致的小鼠自發性運動的增加[24]。1993年，TsunodaT等報道，當茶氨酸用量達1.740 mg/kg時，可顯著抑制咖啡因引起的神經系統興奮[25]。人和動物的大腦皮層都會產生很微弱的腦電波，根據其頻率不同可分為4種：熟睡時為0.5～3Hz的δ-波，淺睡(假寐)時為 4～7Hz的 θ-波，安靜狀態時為8～13Hz的α-波，興奮狀態時為14Hz以上的β-波。α-波的產生是人身體產生舒暢、愉快感覺的標志。茶氨酸能促進α-波產生，從而引起舒暢、愉快的感覺，并且茶氨酸不會引起θ-波數量的增加，因此茶氨酸在使人情緒穩定的同時還能使注意力更加集中。

3.1.2 抗疲勞作用

王小雪等[26]研究證明了茶氨酸具有抗疲勞的作用。經口給予小鼠不同劑量的茶氨酸30d，能明顯延長小鼠負重游泳的時間，減少肝糖原的消耗量，降低運動時血清尿素氮水平；對小鼠運動后血乳酸升高有明顯的抑制作用，能促進運動后血乳酸的消除。因此，茶氨酸具有抗疲勞作用。其機理可能與茶氨酸可抑制5-羥色胺分泌，促進兒茶酚胺分泌有關 (5-羥色胺對中樞神經系統具有抑制作用，而兒茶酚胺具有興奮作用)。

3.1.3 對腦神經細胞起保護作用

茶氨酸的神經保護作用最早由Nozawa等于1998年發現。我國學者也發現茶氨酸預處理組的神經特異性烯醇化酶(NSE)含量、腦組織活檢超微結構、腦含水量指標、白介素-8(IL-8)的含量，均較腦缺血組有顯著的改善，提示茶氨酸具有神經保護作用。實驗還顯示茶氨酸預處理組在再灌注30min時NSE含量與假手術組比較無差異，說明用茶氨酸預處理后可能使缺血后腦損害的發生延遲，為進一步治療爭取寶貴時間(王玉芬等，2006，2007)，避免由腦缺血所致腦神經細胞死亡。

3.1.4 降血壓作用

1995年日本靜岡大學食品和營養學院的H.Yokogoshi報道了茶氨酸降壓的動物實驗。實驗表明喂飼高劑量茶氨酸(1500～2000 mg/kg)，人為升壓的大鼠的收縮壓、舒張壓均有明顯下降，此有效劑量較兒茶素、色氨酸高10～15倍。降壓的機理是通過影響末梢神經血管系統來實現的。當給自發性高血壓大鼠注射不同劑量茶氨酸時血壓下降，尤其在高劑量組可觀察到血壓下降明顯；但對正常血壓的大鼠，即便是給予最高劑量茶氨酸，血壓也不會改變[27]。Hidehiko等給小鼠腹腔注射茶氨酸，自發性高血壓小鼠的舒張壓、收縮壓和平均血壓均明顯下降，并呈量效關系[28]。但茶氨酸是否對人體也有降壓作用卻至今還未見報道。

3.1.5 抗腫瘤作用

茶氨酸抗腫瘤的作用機理是：可增強抗癌藥物的作用效果；減輕某些抗癌藥物的副毒作用；有助于保持細胞的代謝平衡。茶氨酸與DOX同時使用，可以抑制小鼠肝癌細胞的轉移[29]。2001年，Sadzuka等[30]進一步研究茶氨酸提高阿霉素抗癌活性的途徑，指出茶氨酸是通過抑制腫瘤細胞中谷氨酸鹽傳輸而提高阿霉素在腫瘤細胞中濃度，因而提高其抗癌療效。總之，茶氨酸對癌癥患者臨床化學治療是十分有益的，它不僅促進某些抗腫瘤藥物作用，而且還能提高癌癥病人的生活質量。

3.1.6 增強免疫作用

在“非典”流行期間，國內外專家都提到飲茶可增強抵抗力，預防傳染病。據美國研究顯示，茶葉的這種作用可能與茶氨酸有關 (林智，2003)。Jack Bukowski的研究組發現，當接觸到大劑量的茶氨酸體內代謝所產生的乙胺時，γ-δT細胞可以產生抗感染的化學物質(MichaelWRobbins,2004)。而非肽類烷基胺抗原存在于腫瘤細胞、寄生蟲、細菌和真菌以及可食用物品如茶、蘋果、蘑菇等中。用烷基胺預處理過的活體γ-δT細胞會對烷基胺類抗原產生記憶性反應。預處理同樣導致對整個細胞和脂多糖的非記憶性反應。茶氨酸是非肽類抗原乙胺的前體，使外周血液γ-δT細胞接觸到乙胺，從而介導記憶性反應，遇到細菌時可分泌γ干擾素，從而增強人體免疫力[31]。

3.1.7 降脂作用

茶氨酸可以減少體脂含量。用濃度為0.01%、0.02%、0.04%、0.08%和0.16%的茶氨酸溶液飼喂雌鼠16周，發現0.04%的溶液能有效減輕體脂，而其他濃度沒有效果，體重仍然增加，但血清甘油三脂和沒有脂化的脂肪酸及肝臟中的油脂含量顯著下降(Guodong zheng et al,2005)。而用混有0.028%茶氨酸飼料喂養小鼠16周后，其體重比對照群明顯下降，腹腔脂肪降至對照群58%，同時血液中脂肪及膽固醇含量分別減少32%和15%[6]。

3.1.8 提高學習和記憶力的作用

2004年，林雪玲等進行研究證明，無論是水迷宮實驗還是跳臺實驗，不同劑量(100mg/kg,300mg/kg,900mg/kg)的茶氨酸均顯示出增強小鼠學習記憶能力的作用。茶氨酸能縮短正常小鼠游完水迷宮的時間，減少進入盲端的次數；對記憶獲得障礙小鼠可延長首次錯誤的出現時間，減少觸電次數。而且茶氨酸對學習、記憶力的增強作用隨其劑量的增加而增大[32]。

3.1.9 改善經期綜合癥的作用

經期綜合癥(簡稱PMS)是女性在月經前3到10日中出現的精神及身體上的不舒適癥狀。Juneja等考察了茶氨酸對PMS的改善作用，讓24名女性每日服用茶氨酸200 mg，兩個月后PMS癥狀(有頭痛、腰痛、胸部脹痛、無力、易疲勞、煩躁、精神無法集中等)得到明顯改善[33]。但其作用機理還需進一步調查，可能與茶氨酸的鎮靜作用有關 (呂毅等，2003)。

3.1.10 抗衰老作用

2008年，劉顯明等以D-半乳糖致亞急性衰老小鼠為模型，采用Y電迷宮法檢測小鼠學習記憶能力，同時采用酶法測定腦組織勻漿的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)和膽堿酯酶(AchE)活性。研究發現，與模型組比較，茶氨酸可明顯提高衰老小鼠的學習記憶能力，提高SOD和AchE的活性，降低MDA含量。由此說明茶氨酸有明顯的抗衰老作用，而其作用機制可能與其抑制自由基，促進中樞膽堿的功能有關。

3.1.11 抗糖尿病的作用

鋅的異常代謝與某些生理代謝紊亂有關，如出現糖尿病并發癥。鋅在保護糖尿病心肌病人心臟免受各種氧化應激方面起著關鍵作用。補充鋅是預防心臟氧化損傷的重要措施，鋅補充劑可以預防或延緩糖尿病心肌病。雖然茶氨酸單獨使用的降糖效果并不明顯，但茶氨酸-鋅復合物可以明顯降低小鼠KK-Ay血糖和糖化血紅蛋白(HbA1c，與糖尿病視網膜病變有關)水平[34]。茶氨酸-鋅復合物作為鋅補充劑在臨床上用于預防糖尿病綜合癥有積極意義。

3.2 茶氨酸在茶葉及食品領域的應用

3.2.1 飲料的品質、風味改良劑

茶氨酸是茶葉鮮爽味的主要成分，能與糖相互作用，形成揮發性的香氣成分；還可以緩解咖啡堿的苦味和茶多酚的苦澀味，在茶飲料生產中添加一定量的茶氨酸，能明顯改善茶飲料的品質和風味。如日本麒麟公司新開發的“生茶”飲料就添加有茶氨酸，并在日本飲料市場上大獲成功。茶氨酸不僅可以作為茶風味的改良劑，還可以抑制其他食品中的苦味和辣味。例如，可可飲料和麥茶都有獨特的苦味或辣味，添加甜味劑會有一種不適口的味道，如以0.1%的L-茶氨酸替代甜味劑，飲料風味大為改善。研究還證實茶氨酸添加于其他食品(咖啡、人參飲品、啤酒等)中也有改善風味的良好效果。

3.2.2 有鎮靜、抗精神焦慮作用，可提高食品附加值

茶氨酸易溶于水，可以添加于焙烤食品、冷凍點心、糖果、糕點、冰棍、口香糖、罐頭等幾乎所有食品中。添加了茶氨酸的食品不僅有鎮靜安神的作用，而且還可以提高食品本身的附加值。

3.3 茶氨酸在其他方面的應用

除以上用途外，茶氨酸還有減肥，緩解抑郁癥[35]，改善年輕人睡眠，保護心腦血管[36]，減輕酒精對肝臟的傷害作用[37]。茶氨酸可以作為鎮靜藥、抗腐蝕劑、消臭劑、抗酸化劑和預防牙周病的牙膏添加劑，用于化妝品中作保濕劑等。

4 展望

隨著經濟發展，人們生活水平的提高，功能食品已成為人們生活中的一種追求。茶氨酸繼茶多酚之后的又一大功能性物質，安全、無毒、具有多種生理功能。雖然我國在茶葉的生產與消費上居于世界前列，但對茶氨酸的研究還相對滯后。要發揮茶氨酸的功能作用，我們可以從栽培到生產進行系統的研究。

4.1 培育富含茶氨酸的茶樹品種

茶樹品種與茶氨酸含量關系密切，據研究：新梢白化茶樹品種茶氨酸含量高于普通綠茶品種。而栽培技術條件對茶葉茶氨酸含量也有重要影響，氮肥有利于茶氨酸的生物合成和累積；肥料中過量的氯元素不利于茶氨酸的積累，但不影響其在吸收根的累積。茶葉制作過程不同，茶中茶氨酸含量也有明顯變化。因此，可以通過比較從而控制茶樹品種、探究栽培技術條件、改進制茶工藝等來使茶氨酸的天然源頭茶樹中富含茶氨酸。

4.2 加強利用微生物發酵法制備茶氨酸

近幾年來，生物技術的發展迅速。但在我國，利用微生物發酵法來制備茶氨酸的技術還不是很成熟。利用微生物發酵或酶法生產茶氨酸涉及到酶活性的保持及反應條件，如底物濃度、溫度和pH等調控問題。在今后，還應加強這些方面的研究以提高茶氨酸的轉化率、產率及生產效率。

4.3 保健食品領域的應用

在茶氨酸應用方面，應致力于拓寬其在食品領域的應用，利用茶氨酸的特殊生理功能，開發功能性藥物等等。茶氨酸是茶葉中含有的一種特殊氨基酸，具有多種保健功效。茶氨酸復合片劑現正爭取通過國家有關機構的審批認證，這將大大加快我國茶氨酸終端產品的開發。

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