植物RNA病毒寄主因子基因的研究進展

熊 偉

(1.大理學院基礎醫學院,云南大理671000;2.廣西大學生命科學與技術學院,廣西南寧530005)

植物RNA病毒寄主因子基因的研究進展

熊 偉1,2

(1.大理學院基礎醫學院,云南大理671000;2.廣西大學生命科學與技術學院,廣西南寧530005)

文章綜述了植物RNA病毒寄主因子基因的研究進展。

植物;RNA病毒;寄主因子基因

相對于寄主而言,病毒自身所攜帶的遺傳信息是非常有限的,即使是最大的病毒,其基因組也僅僅能編碼幾百個基因,不足寄主編碼基因的百分之一。病毒對寄主的成功侵染的絕大多數步驟都是在病毒與寄主因子的相互作用下進行的。基因極其貧乏的RNA病毒不僅需要寄主因子提供其存活所必須適應的基本環境,還需要寄主因子提供其可以直接利用的資源,寄主因子也因此在RNA病毒的侵染循環中扮演著重要的角色。對于植物RNA病毒,當其穿過細胞壁以及細胞膜進入細胞質后,便利用自身基因翻譯的一些成分與寄主細胞中已存在的一些因子相互作用從而啟動其自身RNA的復制,在細胞質中不停地增殖。現在認為,寄主因子(Host Factors)是寄主細胞在病毒侵染過程(包括病毒入侵、病毒基因表達、病毒粒子裝配及釋放等)中寄主提供給病毒的一切便利條件,寄主細胞內如果缺少這些寄主因子,病毒便不能復制或復制的效率大大降低[1]。

DNA病毒在寄主細胞內的表達可以利用寄主細胞的聚合酶,并受細胞內轉錄因子的調控。但對RNA病毒而言,其基因組的復制、轉錄過程中似乎較少依賴于植物細胞寄主因子的參與。因為真核生物內并不存在相應于RNA病毒復制的機制。曾經認為RNA病毒靠自身編碼的依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)即可完成其復制過程,支持這種觀點的現象是在RNA病毒復制的早期,寄主細胞基因的正常的轉錄和翻譯常常被打斷。與此相悖的是RNA病毒明顯攜帶更小的基因組,其復制過程應該更需要寄主因子的幫助。分離和純化這些在RNA病毒復制時起作用的寄主因子對了解病毒與寄主的相互作用以及闡明RNA病毒復制的分子機制十分重要。例如當煙草花葉病毒TMV進入植物寄主細胞后,其基因組編碼的復制酶便以正鏈ssRNA為模板合成負鏈RNA,再以負鏈RNA為模板合成正鏈RNA。單純的183 kD的TMV復制酶并不能有效地起始TMV的復制,它需要與寄主因子相結合形成復制酶復合體并結合在宿主細胞的內質網或微管上[2];因此,鑒別RNA病毒寄主因子基因并闡明功能也就成了病毒與宿主相互作用領域非常重要的研究前沿。本文將在植物中已經發現的與RNA病毒復制有關的寄主因子基因綜述如下。

1 TOM基因家族

在擬南芥—煙草花葉病毒系統已發現的與TMV復制酶相結合的寄主因子主要是擬南芥TOM基因家族,包括At TOM1,A t TOM2,At-TOM3三個基因,目前已經證實這三個基因與TMV基因組RNA的復制及亞基因組的mRNA合成相關。

1.1 A t TOM1基因

擬南芥A t TOM1基因是Ishikawa等[3]最早分離出來的,At TOM1基因突變株系用甲基磺酸乙酯(EMS)誘導擬南芥的種子獲得。接種病毒株TMV-Cg后,突變株PD114上TMV-Cg外殼蛋白的含量比野生型擬南芥的低。將TMV-Cg的RNA用電穿孔的方法導入PD114的原生質體,與野生型相比,檢測到的TMV-Cg的正鏈RNA(包括基因組RNA和亞基因組mRNA)和外殼蛋白量相對減少。而亞基因組mRNA和外殼蛋白的減少趨于同步,說明只要存在mRNA,就可以以正常效率翻譯得到外殼蛋白,因此,可以推測At TOM1編碼的寄主因子作用的是病毒的基因組RNA在被侵染細胞中的有效復制。缺失TOM1基因雖能抑制TMV RNA的復制,但不影響擬南芥的正常生長發育。從擬南芥中克隆出的TOM1基因mRNA全長1369 bp(Genebank Accession No.AB016925),含一個長為876 bp的ORF,編碼291個氨基酸組成的蛋白質。該蛋白質由幾個高度疏水的區域組成。計算機模擬試驗表明,它是一個六次或七次跨膜的蛋白,N末端位于膜外,在第28～31位氨基酸與168～171氨基酸處有N-糖基化位點。這種蛋白可以與TMV編碼的解旋酶功能域相互作用,而TMV復制酶復合體與膜聯合在一起,推測A t TOM1編碼的跨膜蛋白作為膜的錨定物(membrane anchor)參與了復制酶復合體的形成[4]。

1.2 At TOM2基因

A t TOM2基因是Ohshima等[5]用快中子輻射的方法處理擬南芥的種子時,獲得的抗TMV的擬南芥突變體。該突變體不同于用EMS處理的tom1突變體,它是由于另一位點TOM2基因發生突變。TOM2基因位于擬南芥1號染色體的中部區域,而TOM1基因位于擬南芥4號染色體的長臂。在TOM2基因發生突變的擬南芥原生質,接種TMV后,TMV RNA與CP的積累水平明顯比野生型的積累水平低,表明TOM2基因的產物也是TMV高效復制所必需的。最近的研究證實tom2突變株涉及到寄主基因組核酸大約20kb的缺失,缺失區域包括A t TOM2A、A t-TOM2B兩個基因,都與tom2突變株的表型有關。A t TOM2A編碼一個280氨基酸的跨膜蛋白質,At TOM2B編碼一個122氨基酸的基本蛋白質。A t TOM2A與A t TOM1連在一起相互作用定位到擬南芥的內質網膜上的,也是TMV復制復合體中的重要組成成分。

1.3 At TOM3基因

Yamanaka等[6]將TOM1基因突變的擬南芥突變體進行二次突變,結果使TMV的復制幾乎完全被抑制。分析表明擬南芥的2號染色體上的一個位點TOM3基因發生了突變。TOM3基因全長cDNA ORF編碼301個氨基酸,與TOM1有56%的同源性,含有高度疏水的區域,也是7次跨膜的蛋白。推測TOM3也是細胞質中膜結構相結合蛋白質,它與TMV的復制蛋白相結合而使TMV RNA定位在膜上,便于TMV的高效復制。TOM3基因在病毒復制過程中與TOM1基因起同等重要的作用。

TOM基因家族中的另一個成員是T H H1基因[7](TOM3 Homolog),它也與RNA病毒的復制有關。

2 幫助病毒在寄主細胞間移動的寄主基因

病毒在寄主細胞間的移動需要病毒編碼的運動蛋白(movement protein,MP)以及寄主編碼的因子的參與才能實現。在擬南芥中,蕪菁脈明病毒(Turnip vein clearing virus,TVCV)在VSM1基因發生突變的植株中不能像在野生型植株那樣能在整株中擴散。進一步研究發現,VSM1基因發生突變的植株能有效地阻斷病毒從接種部位進入植物運輸水分及養分的導管。但是VSM1基因發生突變的植株只能阻止煙草花葉病毒屬的病毒進入導管,而不能阻止香石竹斑駁病毒屬(Carmovirus)的病毒進入植株的導管,意味著不同屬的病毒需要不同的寄主因子的參與下才能進入導管從而擴散到植株的其他部位[8]。Matsushita等[9]在煙草中鑒定了一種轉錄激活子MBF1,它能與煙草運動蛋白相結合而調節煙草的基因表達使病毒能在細胞間長距離運輸。在擬南芥中也分離出多種基因(CUM1,CUM2-1),其編碼的產物與病毒運動蛋白相互作用而介導病毒在寄主細胞與細胞之間的運輸。Chen等[10]利用蛋白質的相互作用從TMV感染的煙草中檢測到一種煙草細胞壁中分子量約為38 kD的蛋白,并純化了這種蛋白,鑒定為PME(Pectin Methylesterase)。它能與TMV MP的一定區域相結合而使TMV能在胞間擴散,如果MP缺失這一區域而不能與PME相結合,則TMV不能在胞間擴散。同樣,如果細胞中沒有PME,TMV也同樣不能在胞間擴散。植物中這種基因能編碼阻止或減緩這種運動的蛋白質,因此,它對病毒具有廣譜抗性。另外,在用TEV篩選擬南芥突變株時,發現突變RTM1或RTM2,TEV就失去了在植株中系統移動的能力。

3 真核生物翻譯啟始因子3(eIF3)

大量的遺傳及生物化學信息表明,寄主蛋白也是植物RNA病毒復制復合體的一部分,如TMV、BMV、黃瓜花葉病毒(CMV)、豇豆花葉病毒(CoMV)、紅三葉死花葉病毒(RCNMV)和蕪菁花葉病毒(TYMV)等多種病毒的RdRp至少與一種寄主蛋白共純化。然而,絕大多數寄主蛋白本身的性質及其在病毒復制過程中的作用還不甚清楚。不過,有實驗數據表明,真核生物翻譯啟始因子3(eukaryotic translation initiation factor 3,eIF3)在TMV、BMV的復制過程中起到重要的作用。

Osman等[11]和Wahanabe等[12]發現從被侵染的馬鈴薯葉片中分離到的TMV RdRp包含幾種寄主蛋白,其中有一種56 kD的蛋白與酵母的eIF3中的GCD10亞基存在血清學相關性。GCD10蛋白的抗體可抑制RdRp作用下的TMV基因組RNA及雙鏈RNA的合成;如果預先加入純化的GCD10蛋白,則GCD10蛋白的抗體不降低TMV基因組RNA及雙鏈RNA的合成效率,表明這種類似GCD10亞基的蛋白與TMV的復制有關。在酵母雙雜交系統中,酵母eIF3的GCD10亞基與TMV的126/183 kD復制酶蛋白的甲基轉移酶功能域進行選擇性相互作用,進一步證實了GCD10亞基參與TMV RNA復制這一結論[13]。

從被侵染的大麥中提取的BMV RNA聚合酶包含一種大麥蛋白,這種大麥蛋白與小麥胚eIF3 41kD基因存在血清學關系,與BMV的2a蛋白有高度的親和力和專化性,而且加入小麥胚eIF3或來自小麥胚的41 kD亞基時,RdRp能在體外特異性合成BMV的負鏈RNA,復制能力提高3倍。在活體內,與eIF3 41kD亞基同源的蛋白與BMV的RdRp結合在一起,并參與BMV RNA的復制[14]。與BMV RdRp結合的45 kD大麥蛋白和TMV復制酶復合體的56 kD馬鈴薯蛋白分別與eIF3不同的亞基相對應,說明這兩種寄主蛋白之間無同源關系,并在各自病毒的復制過程中起不同的作用。

4 S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因(SA H H)

SA H H基因通過調節細胞的S-腺苷高半胱氨酸(SAH)與S-腺苷甲硫氨酸的比例來控制生物的甲基化反應。DNA與蛋白質的甲基化與去甲基化在許多生物的信號傳導中扮演著十分重要的作用。另外,SAHH也可能通過調節SAH/SAM的比例來控制mRNA 5’端帽子的甲基化。抑制細胞內SAHH的活性可能會降低宿主mRNA或病毒mRNA 5’端甲基化帽子的甲基化程度。實際上,SAHH是一種很有效的抗動物病毒的抑制劑,也能抑制植物病毒的復制[15]。Chikara等[16]將SA H H基因反義轉入煙草中,獲得部分抗TMV的植株,TMV在轉基因煙草中的局部壞死斑更少更小,對其他煙草也能推遲系統感染的時間。同時,轉SA H H的部分煙草也能抗CMV與PVX。接種CMV后,產生系統性感染的時間明顯推遲,接種PVX 2個月后,都未能有可見癥狀,說明利用反義抑制SAHH基因能提高植物的抗病毒能力。但轉SAHH基因的煙草有一半表現生長改變,甚至有的出現生長輕微矮化。SA H HcDNA為1818 bp(GeneBank Accession No.D45204),編碼產生由485個氨基酸組成的蛋白質。

5 真核生物延長因子1A基因(eEF1A)

TMV的RNA基因的3’端缺少Poly(A)的結構,而具有類tRNA結構。此類tRNA結構對TMV RNA的翻譯復制具有重要的作用,它能與宿主延長因子1A(eEF1A)相結合而啟動TMV RNA負鏈的合成,提高TMV RNA的復制效率[17],如果能降低寄主細胞內的延長因子1A基因的表達水平就有可能抑制TMV的復制。通過轉入外源的延長因子1A基因來沉默內源的延長因子1A基因,從而獲得抗TMV的植株。

6 其他已發現的與病毒復制有關的植物寄主因子

除了上述已介紹的一些植物寄主因子外,發現蕪菁黃花葉病毒的復制與寄主EF-1α、elF3和Tubulin有關[18],這些寄主因子基因是否能用于構建抗病毒植物仍需進一步研究。

7 問題與展望

自從1986年Powell等將TMV的外殼蛋白基因導入煙草,獲得第一例抗病毒轉基因煙草以來,又有許多抗病毒基因工程策略應用于植物,成為防治植物病毒病的主要方法。一種方法是將來源于病毒自身的基因或基因的調控序列導入受體植物,從而獲得病毒起源抗性(pathogen-derived resistance)的抗病毒植株,但是利用這種方法得到的抗病毒植株一般表現為垂直抗病性,而且,將來源于病毒的基因轉入植物而使植物獲得抗病毒的能力這一方法存在潛在的危險因素;另一種方法是利用植物本身的抗病基因(如N基因)來獲得抗病毒植物。

研究植物RNA病毒的寄主因子能進一步揭示RNA病毒復制的分子機制,同時為提出新的抗病毒策略提供理論依據。如At TOM1和At-TOM3等基因突變后,突變株在常規的栽培管理條件下正常生長,而煙草花葉病毒(TMV)復制受抑制,使得通過誘變寄主因子基因獲得抗病毒(或耐病毒)植株成為可能;另有研究發現,黃瓜花葉病毒(CMV)在擬南芥細胞間轉移,必須依賴于CUM1及CUM2基因[19]。對寄主因子的研究為抗病毒基因工程提供了一條新的途徑,即將寄主細胞中支持RNA病毒復制的基因敲除或沉默,使其提供不了病毒復制所需的條件,從而達到獲得廣譜性抗病毒植株的目的。相信隨著實驗技術的不斷發展與成熟,不久的將來會有越來越多的植物RNA病毒寄主因子基因被發現,利用基因沉默技術抑制寄主因子基因能培育出大量新型的抗病毒種質。

[1] Kariainen L.Function of alphavirus nonstructural proteins in RNA replication[J].Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,2002,71:187-222.

[2] 徐耀先,周曉峰,劉立德.分子病毒學[M].武漢:湖北科學技術出版社,2000.

[3] Ishikawa M,Naito S,Ohno T,et al.Effects of the TOM1 mutation ofA rabidopsis thalianaon the multiplication of tobacco mosaic virus RNA in protoplasts[J].Journal of Virology,1997,67:5328-5338.

[4] Hagiwara Y,Komoda K,Yamanaka T,et al.Subcellular localization of host and viral proteins associated with tobamovirus RNA replication[J].EMBO J,2003,22(2):344-353.

[5] Ohshima K,Taniyana T,Yamanaka T,et al.Isolation of a mutant ofA rabidopsis thlianacarrying two simultaneous mutations affecting tobacco mosaic virus multiplication within a single cell[J].Virology,1998,243:472-481.

[6] Yamanaka T,Ohta T,Takahashi M,et al.TOM1,anA rabidopsisgene required for effiicient multiplication of a tobamovirus,encodes a putative transmembrane protein[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:10107-10112.

[7] Yamanaka T,Imai T,Satoh R,et al.Complete inhibition of tabamovirus multiplication by simultaneous mutations in two homologous host genes[J].Journal of Virology,2002,76:2491-2497.

[8] Lartey R T,Ghoshroy S,Citovsky V,et al.Identification of anA rabidopsis thalianamutation(vsm1)that restricts systemic movement of tobamoviruses[J].Mol Plant Microbe Interact,1998,11(7):706-709.

[9] Matsushita Y,Miyakawa O,Deguchi M,et al.Cloning of a tobacco cDNA coding for a putative transcriptional coactivator MBF1 that interacts with the tobacco mosaic virus movement protein[J].Journal of Experimental Botany,2002,53:1531-1532.

[10] Chen M H,Sheng J S,Geoffrey H,et al.Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement[J].EMBO J,2000,19:913-920.

[11] Osman T A,Buck K W.The tobacco mosaic virus RNA polymerase complex contains a plant protein related to the RNA-binding subunit of yeast eIF-3[J].Journal of Virology,1997,71:6075-6082.

[12] Wahanabe T,Honda A,Ueda S,et al.Isolation from tobacco mosaic virus-infected tobacco of a solubilizedtemplate-specific RNA-dependent RNA polymerase containing a 126k/183k protein heterodimer[J].Journal of Virology,1999,73:2633-2640.

[13] Taylor D N,Carr J P.The GCD10 subunit of yeast eIF-3 binds the methyltransferase-like domain of the 126 and 183 kD replicase proteins of tobacco mosaic virus in the yeast two-hybrid system[J].Journal of General Virology,1995,81:1587-1591.

[14] Quadt R,Jaspars E M J.Purification and characterization of brome mosaic virus RNA-dependent RNA polymerase[J].Virology,1990,178:189-194.

[15] Bethin K E,Cimato T R,Ettinger M J.Copper binding to mouse liver S-adenosylhomocysteine hydrolase and the effects of copper on its levels[J].J Biol Chem,1995,9:270-275.

[16] Masuta C,Tanaka H,Uehara K,et al.Broad resistance to plant viruses in transgenic plant conferred by antisense inhibition of a host gene essential in S-adenosylmethionine-dependent transmethylation reactions[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:6117-6119.

[17] Vladimir V,Zeenko,Lyubov A,et al.Eukaryotic elongation 1A interacts with the upstream pseudoknot domain in the 3’-untranslated region of tobacco mosaic virus RNA[J].Journal of Virology,2002,76(11):5678-5691.

[18] Anderson J M,Palukaitis P,Zaitlin M,et al.A defective replicase gene induces resistance to cucumber mosaic virus in transgenic tobacco plants[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:8759-8763.

[19] Yoshii M,Yoshioka N,Ishikawa M,et al.Isolation of anA rabidopsis thalianamutant in which the multiplication of both cucumber mosaic virus and turnip crinkle virus is affected[J].Journal of Virology,1998,72:8731-8737.

Abstract:This paper reviews the research advances of RNA virus host factor gene in plant.

Key Words:plant;RNA virus;host factor gene

The Research Advances of RNA Virus Host Factor Gene in Plant

Xiong Wei1,2
(1.College of Basic Medicine,Dali University,Dali,Yunnan671000,China;2.College of Lif e Science and Technology,Guangxi University,N anning,Guangxi530005,China)

Q75;S432.4+1

A

1671-2544(2010)03-0015-05

2010-02-19

熊 偉(1982— ),男,湖南株洲人,大理學院基礎醫學院講師,云南大學生命科學學院博士研究生。

(責任編輯:陳錦華)