不同免疫途徑對Sj童蟲細胞型免疫原誘生的保護性效果及抗體應答差異*

劉碧源,曾慶仁,余 平,李艷琴,魏 琦,楊勝輝,劉 彥,張順科,蔡力汀

2.南華大學公共衛生學院及醫學院,衡陽 421001

不同免疫途徑對Sj童蟲細胞型免疫原誘生的保護性效果及抗體應答差異*

劉碧源1,2,曾慶仁1,余 平1,李艷琴1,魏 琦1,楊勝輝1,劉 彥1,2,張順科1,蔡力汀1

目的比較研究小鼠經不同途徑接種日本血吸蟲(Schistosoma japonicum,Sj)童蟲原代細胞(primary juvenile worm cells,pJCs)后所誘導的免疫保護效果,尋找其合適的免疫途徑。方法將pJCs經皮下或靜脈注射途徑免疫昆明小鼠,間隔2w共免疫3次,末次免疫后第4w,與對照組同時經腹部皮膚感染尾蚴30±2尾/鼠,比較三組小鼠的肝臟蟲卵數及蟲卵肉芽腫的大小、成蟲數、蟲體大小。同時在第2、3次免疫前及攻擊感染前1d,小鼠尾靜脈采血,用ELISA法檢測抗pJCs-IgG水平。結果pJCs免疫小鼠后,與PBS對照組比,靜脈免疫組的減蟲率為48.53%、肝卵減少率為54.54%、蟲體平均重量減少率為29.62%(P＜0.01)、蟲卵肉芽腫面積減少率為36.8%,而皮下免疫組分別為41.28%、43.19%、23.08%、31.2%。IgG抗體水平也是靜脈注射組高(PBS組,P＜0.01;皮下注射組,P＜0.05)。結論日本血吸蟲童蟲細胞免疫原通過皮下和靜脈注射均可誘導小鼠產生對日本血吸蟲的免疫保護力,其中靜脈注射誘導的免疫保護效應最強,提示通過靜脈注射日本血吸蟲童蟲細胞是可行有效的免疫途徑。

日本血吸蟲;童蟲原代細胞;免疫應答;免疫保護

2.南華大學公共衛生學院及醫學院,衡陽 421001

血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康的寄生蟲病。雖然采取綜合的吡喹酮化療和滅螺等治理措施,但是目前仍有幾百萬人群和各種家畜受到感染。因此,血吸蟲疫苗的研究與開發仍然是血吸蟲病防治的重點之一。迄今為止,WHO推薦的6種最具有希望的血吸蟲疫苗候選分子免疫動物后,均不能穩定地獲得40%以上的保護力。我們課題組一直致力于日本血吸蟲細胞培養,取得了重要的研究成果〔1-2〕。在此基礎上觀察了日本血吸蟲童蟲細胞免疫小鼠后能誘導產生顯著的免疫保護性效果。同時對該免疫原的免疫部位、免疫次數和免疫劑量進行了優化〔3-5〕。本研究中,我們選擇前期免疫保護作用顯著的12d日本血吸蟲童蟲細胞作為免疫原,通過靜脈注射和皮下注射兩種不同的途徑進行免疫接種,比較它們在特異性的體液免疫應答和免疫保護中的作用,為全面評價日本血吸蟲童蟲細胞型疫苗的免疫效果提供理論依據,也為疫苗的改進和研發提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 寄生蟲和實驗動物日本血吸蟲(中國大陸株)陽性釘螺由湖南省血吸蟲病防治所提供。健康6～8w齡雌性昆明小鼠、新西蘭兔均購自中南大學動物學部。

1.2 免疫原的制備免疫原的制備參照文獻〔3〕:用門靜脈灌注法從日本血吸蟲尾蚴感染兔收集第12d的童蟲,用含抗生素(1 000IU/mL青霉素G和1 000μ g/mL鏈霉素)無菌 PBS反復洗滌后,將蟲體在300目網篩上輕輕研磨,加入少許PBS后過濾掉蟲體碎片。含細胞濾液用于免疫原的制備:收集沉淀細胞用PBS離心洗滌3次,然后用PBS調整細胞濃度為2×107個/mL為原代童蟲細胞(primary juvenile worm cells,pJCs),直接用于第1次免疫或經液氮凍存后復蘇、洗滌,用于第2、3次免疫。免疫前,所有細胞用PBS調整濃度為2×107個/mL。

1.3 免疫方案及攻擊感染30只昆明小鼠隨機分為pJCs雙側腹股溝皮下多點注射組、pJCs尾靜脈注射組、PBS皮下注射組。pJCs免疫原為12d的血吸蟲童蟲細胞,調整細胞量約為2×107個/mL,接種量為100μ L/鼠/次 ,對照組注射 PBS 100μ L/次/鼠,各組小鼠平行在0、14和28d分別進行1次免疫。第2、3次免疫前及攻擊感染前1d,均作小鼠尾靜脈采血,用ELISA法檢測抗pJCs-IgG水平。末次免疫后第4w經腹部皮膚感染尾蚴30±2尾/鼠。

1.4 保護性效果的測定感染后第42d,乙醚麻醉、眼眶放血后剖殺小鼠,用肝門靜脈灌注法沖蟲,分組收集蟲體,計算減蟲率;將收集的各組蟲體稱重,觀察蟲體發育情況。灌注后取鼠肝,部分用于病理組織切片測量肝蟲卵肉芽腫大小,部分用于肝蟲卵計數。蟲卵計數方法,每鼠取1g肝組織勻漿,置于5mL 4%KOH中,37℃搖勻消化過夜,取 200μ L肝組織消化混懸液涂片鏡下計算蟲卵,得出每克肝卵數(liver eggs per gram,LEPG)。減蟲率、LEPG減少率均按下列公式計算:LEPG減少率(減蟲率)=[(對照組的平均數-實驗組的平均數)/對照組的平均數]×100%。組織病理學觀察,每鼠取肝中葉按常規固定,石蠟包埋、切片后作蘇木素-伊紅(HE)染色,用Motic Images Advanced 3.2病理圖象分析系統測量所有單個含毛蚴的蟲卵的肉芽腫面積,取各組平均值進行比較分析。

1.5 ELISA檢測特異性IgG抗體水平 于第2、3次免疫前及攻擊感染前1d收集各試驗組小鼠的血清,用ELISA法檢測特異性抗血吸蟲童蟲細胞IgG抗體。先將12d血吸蟲童蟲反復凍融、超聲粉碎,離心取上清為可溶性童蟲細胞抗原(soluble juvenile worm antigen,SJWA)。SJWA 用pH9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋,按1μ g/孔濃度包被96孔板,4℃過夜,封閉、洗滌,用1∶100稀釋的各實驗組小鼠血清37℃孵育2h。所有樣本均設復孔,同時用日本血吸蟲感染鼠血清和未感染鼠血清作為陽性對照和陰性對照。PBST洗滌,加入 1∶4 000的H RP-羊抗鼠 IgG,加TMB底物室溫顯色15min,用5%H2SO4終止,置酶標儀450nm波長測OD值。

1.6 統計學分析 所有數據均表示為均數±標準差(±s)。采用SPSS統計軟件進行Student'st檢驗,P＜0.05為顯著性差異。

2 結 果

2.1 減蟲率、肝卵減少率 pJCs分別通過腹股溝皮下注射和尾靜脈注射的方法免疫小鼠后的減蟲率、減卵率見表1。從表1中可知,與PBS對照組比,皮下注射組的減蟲率為41.28%、減卵率為43.19%(P＜0.05),靜脈注射組的減蟲率和減卵率分別為48.53%和54.54%(P＜0.01)。靜脈注射組與皮下注射組比,兩者差異有顯著性(P＜0.05)。

2.2 蟲體平均重量減少率 從表2可知,與PBS對照組比,皮下注射組的蟲體重量平均減少率為23.08%、靜脈注射組的為26.92%,差異有顯著性(P＜0.01)。靜脈注射組與皮下注射組相比差異有顯著性(P＜0.05)。

2.3 肝臟蟲卵肉芽腫面積減少率 用Motic Images Advanced 3.2病理圖象分析系統對pJCs不同接種途徑免疫鼠肝組織內蟲卵肉芽腫大小進行測量,結果見表3。各免疫組與PBS對照組比,肝卵肉芽腫面積顯著減少(P＜0.05),但靜脈注射組和皮下注射組二者間的差異無顯著性(P＞0.05)。

表1 各組的蟲荷數和每克肝卵數Table 1 Wormburden and LEPG level induced by different immunization routes

表2 各組蟲體的發育情況Table 2 Worm average weights induced by different immunization routes

表3 各免疫組鼠肝卵肉芽腫的面積減少率Table 3 Mean areas of granulomas on liver slides from mice induced by different immunization routes

2.4 抗體水平 圖1可知,免疫后第2w各免疫組IgG抗體開始逐漸上升,到攻擊感染前達最高水平,均明顯高于PBS對照組(P＜0.01);靜脈注射組誘導的抗體水平也明顯高于皮下注射組(P＜0.05)。

圖1 各免疫組及對照組小鼠抗pJCs-IgG動態水平Fig.1 Kinetics of total anti-pJCIgG in pJCs immunized mice by different routes

3 討 論

抗原誘導機體產生免疫應答及免疫應答類型受許多因素的影響,如免疫途徑、抗原緩釋以及抗原的物理狀態等〔6〕。我們在前期研究中已經優化了童蟲細胞抗原的免疫劑量和免疫次數〔4-5〕。為獲得更理想的保護性效果,本研究進一步優化免疫途徑,以選擇能誘導高保護性的適宜免疫途徑。選用前期研究中免疫效果明顯的12d日本血吸蟲童蟲細胞通過尾靜脈注射和腹股溝多點皮下注射兩條途徑分別免疫小鼠,結果發現,與 PBS對照組(感染對照)比,兩次實驗經靜脈注射免疫鼠的平均減蟲率、肝卵減少率和蟲體平均重量減少率分別為48.53%、54.54%和26.92%(P＜0.01),該抗攻擊感染效果與平行試驗的皮下注射組所獲結果比,其差異有顯著性(P＜0.05)。在抗體應答方面,IgG抗體水平也是靜脈注射組高(與PBS比,P＜0.01;與皮下注射組比,P＜0.05)。該結果表明,用12d童蟲細胞通過靜脈注射和皮下注射的方法免疫小鼠均可獲得顯著的保護性效果和較高的抗體水平,尤其是靜脈注射組的效果明顯優于皮下注射組。值得注意的是,我課題組之前報道的皮下免疫效果均高于本次,其原因既可能與細胞制備批間差異(如細胞活力)有關,也可能與不同批動物差異有關〔3-5〕。有關免疫途徑對疫苗免疫效果的影響,研究報道并不完全一致,有的甚至互為矛盾。這可能是不同接種途徑所涉及的抗原提呈不同,免疫效果不同,因而可產生不同類型、不同強度的免疫應答。Porgador and Gilboa〔7〕報道抗原肽刺激的DC疫苗能誘導小鼠產生對腫瘤的保護性免疫。Eggert等〔8〕研究DC疫苗經皮下、腹腔和靜脈輸注后在小鼠體內的分布,結果顯示:靜脈注射后DC迅速分布到肺組織,48h后以脾臟分布最多;而皮下和腹腔注射后DC在肺、肝和脾臟的分布明顯要低。Power〔9〕的研究結果也表明靜脈注射免疫途徑效果要好。這可能是由于靜脈注射的抗原容易更快地到達二級淋巴器官,迅速與免疫細胞接觸而發揮更好的保護性作用。這些研究報道與我們的研究結果一致,表明通過靜脈注射免疫小鼠也是日本血吸蟲童蟲細胞型疫苗一條可行有效的免疫途徑。

〔1〕龔燕飛,曾慶仁,張祖萍,等.日本血吸蟲童蟲細胞體外培養條件的初步研究〔J〕.中國人獸共患病雜志,2005,21(2):159-163,124.

〔2〕劉偉,曾鐵兵,曾慶仁,等.日本血吸蟲成蟲體外傳代培養細胞的生物學鑒定〔J〕.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2006,24(5):395-397.

〔3〕曾慶仁,林雪遲,龔燕飛,等.一種新型日本血吸蟲疫苗(童蟲活細胞)誘導小鼠產生有效保護性免疫力的研究〔J〕.中國現代醫學雜志,2004,14(14):84-97.

〔4〕Zeng T B,Cai L T,Zeng Q R,et al.Immunization of mice with cells from juvenile worms ofSchistosoma japonicumprovides immunoprotection against schistosomiasis〔J〕.Science in China Series C:Life Sciences,2007,50(6):1-9.

〔5〕Cai L,Zeng T,Zeng Q,et al.Schistosoma japonicum:protective immunity induced by schistosomulum-derived cells in a mouse model〔J〕 .J Parasitol,2008,94(2):395-403.

〔6〕金伯泉.醫學免疫學〔M〕.北京:人民衛生出版社,2008:32.

〔7〕 Porgador A,Gilboa E.Bone marrow-generated dendritic cells pulsed with a class I-restricted peptide are potent inducers of cytotoxic T lymphocy tes〔J〕.J Exp Med,1995,182(1):255-260.

〔8〕Eggert AA,Schreurs M W,Boerman OC,et al.Biodistribution and vaccine efficiency of murine dendritic cells are dependent on the route of administration〔J〕.Cancer Res,1999,59(1):3340-3345.

〔9〕Power CA,Wei G,Bretscher PA.Mycobacterial dose defines the Th1/Th2 nature of the immune response independently of whether immunization is administered by the intravenous,subcutaneous,or intradermal route〔 J〕.Infection and Immunity,1998,66(12):5743-5750.

Comparison of the immune protective effect and antibody response of primary cells fromschistosomulumby two different immunization routes in mice

LIU Bi-yuan1,2,ZENG Qing-ren1,YU Ping1,LI Yan-qin1,WEI Qi1,YANG Sheng-hui1,LIU Yan1,2,ZHANG Shun-ke1,CAI Li-ting1

(1.Cell&Molecular Biological Experiment Center and Department of Immunology and Parasitology,Xiangya Medical School,the Central South University,Changsha410013,China;
2.School of Public Health and Medicine,University of South China,Hengyang421001,China)

In order to observe the influence of immunization route on the immune protective effects induced by primary juvenile worm cells(pJCs),Kunming mice were inoculated intravenously or subcutaneously with pJCs from 12 day-oldSchistosoma japonicumrespectively.All mice were immunized three times at 2 weeks interval and were challenged each with 30±2 cercariae by abdominal skin penetration 4 weeks after the last booster.Six weeks of post-infection,mice were sacrificed by aether inhalation,and the numbers of worms and hepatic eggs were counted.Specific anti-pJCs levels in the mice sera collected one day before the second,third immunization and challenge infection were tested with ELISA.Mice immunized with pJCs given i.v.or s.c.exhibited high level of specific antibody and protection effects,but given i.v.was significantly higher than given s.c.in anti-pJCs level(P＜0.05)and showed significant reduction in worm burden(48.53%),liver eggs per gram(LEPG)load(54.54%),worm average weight(29.62%)and egg granuloma size(36.8%).The juvenile worm cells ofS.japonicumcould induce partial protective immunity againstS.japonicumin mice and the protective immunity by i.v.was better than that by s.c..These results indicated intravenous route was a feasible and efficacious route for juvenile worm cell immunization.

Schistosoma japonicum;primary juvenile worm cell;immune response;immunoprotection

R383.2

A

1002-2694(2010)07-0615-03

*國家自然科學基金(30570952)資助

余平,Email:yuping1953@sina.com

1.中南大學湘雅醫學院免疫學系及細胞與分子生物學實驗中心,長沙 410013;

2009-12-20;

2010-03-29