實時定量PCR檢測siRNA對小鼠巨噬細胞中FTH1基因表達的抑制作用*

杜軍偉,王遠志,陳創夫,葛陽春,唐利燕

2.新疆民族與地方高發病教育部重點實驗室,石河子832003

實時定量PCR檢測siRNA對小鼠巨噬細胞中FTH1基因表達的抑制作用*

杜軍偉1,2,王遠志2,陳創夫2,葛陽春1,2,唐利燕1,2

目的通過實時定量PCR(real-time PCR)檢測基因表達的mRNA,建立一種直接觀察小干擾RNA(siRNA)抑制目的基因表達的方法。方法化學設計合成對應于FT H1(ferritin heavy chain 1,FTH1)基因表達mRNA的siRNA,經TurboFectTMin vitro Transfection Reagent轉染小鼠RAW264.7巨噬細胞,48h后,提取總 RNA,逆轉錄為cDNA。以 3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參,定量檢測FTH1的表達,比較干擾前后FT H1基因mRNA的量。結果3種siRNA處理的小鼠巨噬細胞中FT H1基因的表達抑制率最高為97.60%。結論實時定量PCR方法的建立為研究布魯氏菌在侵染巨噬細胞過程中FTH1的功能提供了有效途徑。

實時定量PCR;siRNA;小鼠RAW264.7巨噬細胞;FT H1

2.新疆民族與地方高發病教育部重點實驗室,石河子832003

布魯氏菌病是嚴重危害畜牧業的動物源性傳染性疾病,主要感染反芻動物和人類〔1〕。其病原為布魯氏菌(Brucella),是一種兼性細胞內寄生的致病菌,人感染后常表現為持續性感染,可引發生殖系統損傷、腦膜炎、心內膜炎、關節炎等,甚至會喪失勞動能力〔2〕。家畜感染后造成流產、空懷等〔3〕,給畜牧業生產造成嚴重經濟損失。巨噬細胞是布魯氏菌生存和繁殖的靶細胞。IV型分泌系統(VirB)是布魯氏菌毒力基因,與布魯氏菌在宿主細胞內生存、復制有關。VirB區段包括 12個基因,形成一個操縱子。VirB系統的結構功能研究顯示:VirB2和VirB5位于細菌表面,形成菌毛樣結構〔4-5〕。王遠志等〔6〕運用酵母雙雜交技術從綿羊種布魯氏菌019株侵染綿羊巨噬細胞的cDNA文庫中成功的篩選出鐵蛋白重鏈多肽(ferritin heavy chain 1,FT H1)與布魯氏菌019株VirB5相互作用,但是FTH1在布魯氏菌侵染巨噬細胞中的作用機制仍不清楚,本試驗通過運用RNA干擾技術下調FTH1的表達,并運用熒光實時定量技術來檢測干擾后FT H1基因mRNA的表達量。從而為下一步檢測FTH1在布魯氏菌侵染巨噬細胞中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 小鼠RAW264.7巨噬細胞株購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫;宿主菌 DH5a由本實驗室保存;RNAi表達載體RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen Vector試劑盒購自美國BD Bioscience Clontech公司;限制性內切酶MUL-I、反轉錄酶M-MLV購自大連生物工程有限公司;DMEM培養基、小牛血清購自GIBCO公司;TurboFectTMin vitro T ransfection Reagent轉染試劑盒、Trizol購自Invitrogen公司;熒光定量PCR試劑盒購自博奧公司;無內毒素質粒大提試劑盒購自天根生化科技有限公司;其他試劑為國產分析純產品。LSM510激光共聚焦顯微鏡:新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室;Smart CyclerⅡ實時定量PCR儀:Cepheid公司。

1.2 方法

1.2.1 表達FT H1的siRNA的設計 將小鼠FTH1基因(GenBank,No:NM_010239)提交到Ambion公司的 shRNA查找網站(http://www.ambion.com/techlib/misc/shRNA_finder.html),針對FTH1基因分別確定了3對陽性siRNA片段,1對與其它物種基因序列均無同源性的陰性對照序列,合成的siRNA對應的DNA序列如表1。

表1 合成shRNA對應DNA序列Tab.1 Synthesized DNA Sequence corelated to siRNA

1.2.2 RNA干擾FT H1基因的綠色熒光蛋白表達載體pSIREN-siRNA的構建 按照RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen Vector試劑盒說明書進行,將合成的 siRNA正反義鏈 DNA片段稀釋到100 μ mol/L;按照摩爾比 1∶1 混合后,95℃ 30 s,72℃2 min,37℃2 min,25℃2 min,PCR儀上合成雙鏈;稀釋至 0.5 μ mol/L后,進行與 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen Vector的連接,分別命名為pSIREN-A/B/C/D;挑取陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序,將鑒定正確的克隆菌,按照無內毒素質粒大提試劑盒(天根生化科技有限公司)說明書大量制備質粒,-20℃備用。

1.2.3 轉染 小鼠巨噬細胞RAW264.7用含10%小牛血清DMEM培養基(100U青霉素/mL、100U鏈霉素/mL),將處于對數生長期的細胞置于12孔細胞板中,在 37℃、5%CO2條件下培養24h后,用 TurboFectTMin vitro Transfection Reagent轉染試劑按說明書進行轉染,試驗將pSIREN-D轉染組設為陰性對照組。轉染后5%CO2,37℃條件下培養48 h,用LSM510激光共聚焦顯微鏡觀察細胞中的綠色熒光表達蛋白。

1.2.4 實時定量PCR引物設計 用Pimer 3.0軟件分別針對目標基因FT H1、內參基因GAPDH設計實時定量引物,引物序列見表2。

表2 引物序列Tab.2 Primers sequence

1.2.5 pSIREN-siRNA質粒轉染RAW264.7細胞對FTH1基因表達的作用 實時定量PCR檢測轉入干擾質粒后細胞中FTH1的拷貝數,將結果進行統計學分析。

2 結 果

2.1 RNA干擾FTH1基因的綠色熒光表達載體pSIREN-siRNA的構建結果 經上海生工生物工程技術服務有限公司測序,結果表明所插入的干擾片段分別與FTH1-A/B/C/D序列比對完全正確。2.2 pSIREN-siRNA質粒在細胞內熒光觀察 運用TurboFectTMin vitro Transfection Reagent轉染試劑盒的操作說明進行轉染,在48h后用LSM510激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細胞中的綠色熒光表達蛋白,經多處采集信息計算出質粒的轉染效率約等于100%,見圖1。

圖1 RAW264.7細胞轉染pSIREN-siRNA表達質粒48h后的熒光照片1.1:48h;1.2:對照Fig.1 The fluorescence of RAW264.7 cells transfected with pSIREN-siRNA expression plasmids1.1:48 h;1.2:control cells.

2.3 實時定量PCR標準曲線的制作 GAPDH的標準曲線方程為:y=-0.22x+12.087,曲線的斜率為-0.22,相關系數為0.996,擴增產物的溶解曲線有一個主峰值,如圖2。

FTH1的標準曲線方程為:y=-0.266x+13.163,曲線的斜率為-0.266,相關系數為0.983,擴增產物的溶解曲線有一個主峰值,如圖3。

2.4 pSIREN-siRNA質粒轉染RAW264.7細胞后干擾效果檢測 以pSIREN-A/pSIREN-B/pSIREN-C/p-SIREN-D四個siRNA,分別對FTH1基因進行干擾(48h),實時定量 PCR檢測干擾前后FTH1基因在細胞中的拷貝數,以相應的FTH1基因檢測值/GAPDH的檢測值作為校正值,再用公式干擾效率(%)=(RNAi陰性對照組-RNAi試驗組)/RNAi陰性對照組×100%進行各個pSIREN-siRNA質粒干擾效果的檢測比較。結果表明FTH1基因的3個試驗組的siRNA干擾質粒都具有干擾效果pSIREN-A為57.60%,pSIREN-B為88.50%,pSIREN-C為97.60%。

3 討 論

布魯氏菌是細胞內寄生菌,Tsuji等〔7-8〕證實鐵蛋白重鏈轉錄起始位點的上游有抗氧化反應元件,可對氧化反應做出應答,保護細胞免受氧化損傷。大量證據表明致病菌的致病力與其攝取鐵的能力直接相關〔9〕,有效的鐵攝取被看作是重要的致病因素,致病菌必須通過高度特異、有效的鐵攝取系統完成鐵的攝入〔10-11〕。

由于布魯氏菌VirB5可以和巨噬細胞中的FTH1相互作用,我們可以推測,FTH1與VirB5結合,誘導布魯氏菌IV型分泌系統將螯合的鐵離子輸入菌體內,提供細菌所需的鐵,從而維持了細菌的毒力;另一方面,感染細胞中的FTH1攝取了胞漿內的游離鐵,減少了二價鐵離子對細胞的損傷,起到抗氧化作用,延緩了細胞的凋亡,從而使布魯氏菌在巨噬細胞內長期生存。在本試驗中,針對FT H1設計干擾質粒,轉染RAW264.7巨噬細胞,在48h后用LSM510激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細胞中的綠色熒光表達蛋白,經多處采集信息,質粒的轉染效率接近于100%。通過實時定量PCR檢測,siRNA干擾質粒pSIREN-C對FTH1基因表達的抑制率最高達到了 97.60%,具有較好的沉默效率,能高效、靶向性降低FT H1基因的表達。通過這一結果,我們可以推測:FT H1基因的表達降低可能會削弱胞內布魯氏菌的毒力,并造成巨噬細胞中的游離鐵離子增多,細胞抗氧化能力減弱,避免了布魯氏菌在巨噬細胞內的長期寄生。通過本試驗為研究新型的藥物來控制布魯氏菌,對巨噬細胞的入侵以及為研究布魯氏菌胞內寄生機制奠定基礎。

〔1〕Pappas G,Papadimitriou P,Akritidis N,et al.T he new g lobal map of human brucellosis〔J〕 .Lancet Infect Dis 2006,6:91-99.

〔2〕 Delrue RM,M artinez-Lorenzo M,Lestrate P,et al.Identification ofBrucellaspp.genes involved in intracellular trafficking〔J〕.Cell Microbiol,2001,3:487-497.

〔3〕尚德秋.中國布魯氏菌病防治科研 50年〔J〕.中華流行病學雜志,2000,21(1):55-57.

〔4〕 Christie PJ,Vogel JP.Bacterial ty pe IV secretion:conjugati-on systems adapted to delier effectormolecules to host cells〔J〕.T rends Microbiol,2000,8:354-360.

〔5〕 Lai EM,Kado CI.T he T-pilus of Agrobacterium tumefacie-ns〔J〕.T rends Microbiol,2000,8:361-369.

〔6〕王遠志.綿羊種布魯氏菌致病的分子機制研究〔D〕.石河子大學,動物科技學院.2008.

〔7〕Tsuji Y,Moran E,T orti SV,et al.Transcriptional regulation of the mouse ferritin H gene.Involvement of p300/CBP adaptor proteins in FER-1 enhancer activity〔J〕.J Biol Chen,1999,274(11):7 501.

〔8〕T suji Y.JunD Activates transcription of the human ferritin H gene through an antiocidant response element during oxidative stress〔J〕.Oncogene,2005,24(51):7 567.

〔9〕Basaraba RJ,Bielefeldt-Ohmann H,Eschelbach EK,et al.Increased expression of host iron-binding proteins precedes iron accumulation and calcification of primary lung lesions in experimental tuberculosis in the guinea pig〔J〕.Tuberculosis,2008,88(1):69-79.

〔10〕Rossi M S,Fetherston FD,Letoffe S,et al.Identification and characterization of the hemophore-dependent beme acquisition system ofYersinia pestis〔 J〕.InfectImmun,2001,69:6707-6017.

〔11〕 Braun V,Braun M.Active transport iron and siderophore antibiotics〔J〕.Curr Opin Microbiol,2002,5:194-201.

Detection of inhibitory effect of siRNA on FTH1 gene expression of mouse RAW264.7 macrophages with rea1-time PCR

DU Jun-wei1,2,WANG Yuan-zhi2,CHEN Chuang-fu2,GE Yang-chun1,2,TANG Li-yan1,2

(1.College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi832003,China;
2.Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease,Shihezi832003,China)

The aim of the present study was to establish an assay of real-time PCR to detect the inhibitory effect of siRNA on gene expression.The chemically synthesized siRNAs matched with ferritin heavy chain 1(FTH1)mRNA were transfected into RAW264.7 macrophages with TurboFectTMin vitroTransfection Reagent.Then the total RNA was extracted from the cells and reversely transcribed into cDNA.The expression of FTH1 was quantified and compared by real-time PCR on the basis of expressions of g1yceraJdehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)as internal control in different groups.Three kinds of siRNAs could significantly inhibited FT H1 mRNA expression in mice RAW264.7 macrophages and the inhibition rate reached to 97.60%.Results demonstrated that the built real-time PCR could be employed in detection of FTH1,which provides a method to study FTH1 function in the course ofBrucellainfection.

real-time PCR;siRNA;mice RAW264.7 macrophage;FTH1

R378.5

A

1002-2694(2010)07-0638-04

*國家自然科學基金(30800813),兵團博士基金(2009JC15),高層次人才科研啟動資金專項(RCZX200828)和973項目(2010CB530200)聯合資助

王遠志,Email:wangyuanzhi621@126.com

陳創夫,Email:ccf-xb@163.com

1.石河子大學動物科技學院,石河子 832003;

2009-11-10;

2010-03-22