補腎化痰中藥對煙熏大鼠慢支模型氣管和肺組織AR表達的影響*

蔣士卿，王淑玲，閆愛華

(1.河南中醫學院，河南 鄭州 45000;2.鄭州大學基礎醫學院，河南 鄭州 450052)

補腎化痰中藥對煙熏大鼠慢支模型氣管和肺組織AR表達的影響*

蔣士卿1，王淑玲2，閆愛華2

(1.河南中醫學院，河南 鄭州 45000;2.鄭州大學基礎醫學院，河南 鄭州 450052)

目的:通過觀察補腎化痰中藥對煙熏大鼠慢支模型氣管和肺組織中AR表達的影響，探討補腎化痰中藥防治慢支的作用機理。方法:將健康雄性Wistar大鼠72只隨機均分為正常對照組、慢支模型組、氣管炎咳嗽痰喘丸組、補腎化痰大劑量組、補腎化痰小劑量組和自然恢復組，每組12只，采用香煙煙霧吸入法建立雄性大鼠慢支模型，在模型復制成功后分別灌胃給藥補腎化痰中藥和氣管炎咳嗽痰喘丸，治療時間為30d，采用免疫組化SP法檢測各組大鼠氣管和肺組織中雄激素受體(AR)的表達，采用放免法測定各組大鼠血清睪酮(T)的含量。結果:與正常對照組比較，慢支模型組和自然恢復組大鼠氣管和肺內支氣管AR的表達水平均明顯升高(P<0.01，P<0.05)，血清T水平明顯下降(P<0.01);與慢支模型組比較，補腎化痰大、小劑量組和氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠氣管和肺內支氣管中AR表達水平顯著降低(P<0.01，P<0.05，P<0.001)，血清 T水平明顯升高(P<0.05)。結論:補腎化痰中藥能使煙熏雄性大鼠慢支模型的氣管和肺組織中AR的高水平表達降低，血清低水平T含量升高，提示補腎化痰中藥調節雄激素及其受體水平可能是其治療慢支的作用機理之一。

雄性大鼠;慢性支氣管炎;補腎化痰中藥;氣管炎咳嗽痰喘丸;雄激素受體(AR)、睪酮(T)、香煙煙霧吸入;免疫組化

本研究采用香煙煙霧吸入法建立雄性大鼠慢支模型，采用免疫組織化學SP法檢測大鼠氣管和肺組織中雄激素受體(AR)的相對含量，探討補腎化痰中藥對雄性慢支大鼠氣管和肺組織中AR表達的影響，為研究補腎化痰中藥防治慢支的作用機制積累資料。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康雄性Wistar大鼠72只，體重180g～220g，由河南省實驗動物中心提供。隨機分為正常對照組、慢支模型組、氣管炎咳嗽痰喘丸組、補腎化痰大劑量組、補腎化痰小劑量組和自然恢復組6組。

1.2 藥物與主要試劑

補腎化痰中藥由何首烏、淫羊藿、蛇床子、五味子、菟絲子、覆盆子、款冬花、紫菀組成，水煎濃縮至每毫升相當于含生藥1.5g;氣管炎咳嗽痰喘丸為中國北京同仁堂集團公司產品，批號1080032，使用時用蒸餾水配制成每毫升含藥物0.105g的混懸液。“鴻禧”牌84mm烤煙型香煙由河南汝州卷煙廠生產，焦油量17mg，煙氣煙堿量1.1mg。抗大鼠AR第一抗體為抗AR羧基端多肽片段的親和純化兔多克隆抗體為Santa Cruz產品;SP系列工作液試劑盒及DAB試劑盒為北京中山生物技術有限公司產品;睪酮(T)放免試劑盒(包被管法)為天津德普生物技術和醫學產品有限公司產品。

1.3 慢性支氣管炎模型的建立

參照文獻方法并進行改良采用香煙煙霧吸入法建立大鼠慢性支氣管炎模型。自制1個1740mm×1100mm×1500mm的煙熏箱，頂部對角留兩個2mm×3mm的通氣孔，將除正常對照組以外的其余5組大鼠分別裝于自制的鋼絲籠內，每籠6只，放置于煙熏箱中的架子上，香煙每份4支，用鐵絲捆扎，點燃后分別懸掛于鋼絲籠下，15min后點燃第二批香煙，共用香煙64支。每次50min，每天2次，38d后改為每天1次，每次50min，用煙量同前，共計76d。

1.4 動物處理及組織切片的制作

慢支模型組于煙熏76d后的當天上午氯胺酮麻醉，腹主動脈抽血，離心分離血清，分裝后 －20℃保存待測，小心剖取氣管和肺，剪取右肺的一葉和氣管放入4%的中性甲醛固定液中;補腎化痰中藥組與氣管炎咳嗽痰喘丸組均采用治療給藥，在停止煙熏的當天，氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠灌胃氣管炎咳嗽痰喘丸藥物混懸液(每毫升含藥物0.105g，相當于成人常規臨床用量的10倍);補腎化痰小劑量組將補腎化痰中藥濃縮液稀釋至每毫升含生藥0.75g灌胃(相當于成人常規臨床用量的5倍);補腎化痰大劑量組直接灌胃補腎化痰中藥濃縮液(每毫升含生藥1.5g，相當于成人臨床常規用量的10倍);自然恢復組給予蒸餾水灌胃;正常對照組不進行煙熏，僅從第76天開始灌胃蒸餾水，每天灌胃1次，連續30d，在灌胃結束后的第2天處死全部大鼠，處死方法和標本收集與慢支模型組相同。

從固定液中取出標本，修塊，乙醇梯度脫水，低熔點石蠟包埋，3μm～4μm切片，用鉻礬明膠處理過的載玻片直接上片。

1.5 AR免疫組化染色及結果判斷

各組大鼠氣管和肺組織的AR免疫組化染色步驟按照試劑盒說明書進行，用PBS代替一抗作為陰性對照，以大鼠睪丸組織標本作為陽性對照，以細胞漿或細胞核內出現明顯棕黃色顆粒為陽性表達。并用高清晰度病理圖文分析系統測定AR陽性細胞的平均灰度和平均光度。

1.6 血清睪酮(T)含量測定

采用SN-695型智能放免γ測量儀檢測各組大鼠血清睪酮(T)水平，操作方法按試劑盒說明書進行。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠氣管中雄激素受體(AR)的表達

表1顯示，與正常對照組(圖1)比較，慢支模型組大鼠(圖2)和自然恢復組大鼠氣管中AR的表達(圖3)均明顯增強(P<0.01);補腎化痰大劑量組氣管中AR的表達(圖4)略強于正常對照組，其差異無統計學意義(P>0.05);自然恢復組大鼠 AR相對含量低于正常對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)。與慢支模型組比較，補腎化痰大劑量組和小劑量組大鼠氣管AR的表達(圖5)明顯減弱(P<0.01)，氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠氣管中AR的表達(圖6)減弱最顯著(P<0.001);自然恢復組大鼠氣管中AR的表達雖略有減弱，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 雄激素受體(AR)在各組大鼠氣管中的表達(±s)

表1 雄激素受體(AR)在各組大鼠氣管中的表達(±s)

注:與慢支模型組比較: P<0.01， P<0.001;與正常對照組比較:△△P<0.01

組別 n 平均灰度 平均光度正 常 對 照 組 12 99.9± 7.75 0.293±0.05 慢 支 模 型 組 12 87.0± 9.60△△ 0.358±0.06△△氣管炎咳嗽痰喘丸組 12 106.7±11.29 0.265±0.04 補腎化痰大劑量組 12 102.8±12.17 0.289±0.06 補腎化痰小劑量組 12 103.2±12.28 0.293±0.05 自 然 恢 復 組 12 90.6± 6.28△△ 0.346±0.03△△

2.2 各組大鼠肺組織中雄激素受體(AR)表達

表2顯示，與正常對照組(圖7)比較，慢支模型組大鼠(圖8)和自然恢復組大鼠肺組織中AR的表達(圖9)均明顯增強(P<0.05)，補腎化痰大劑量組(圖10)和補腎化痰小劑量組大鼠肺組織中 AR的表達(圖11)略強于正常對照組，但無統計學意義(P>0.05);氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠肺組織中AR的表達(圖12)低于正常對照組，但差異也無統計學意義(P>0.05);與慢支模型組比較，補腎化痰大劑量組和小劑量組大鼠肺組織AR的表達明顯減弱(P<0.05或 P<0.01)，以氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠肺組織中 AR的表達減弱最顯著(P<0.01)。用PBS代替一抗的大鼠氣管(圖13)和肺組織(圖14)均無陽性細胞出現。

圖1 AR在正常對照組大鼠氣管的表達免疫組化(×200)

圖2 AR在慢支模型組大鼠氣管的表達免疫組化(×200)

圖3 AR在自然恢復組大鼠氣管的表達免疫組化(×200)

圖4 AR在補腎化痰大劑量組大鼠氣管的表達免疫組化(×200)

圖5 AR在補腎化痰小劑量組大鼠氣管的表達，免疫組化(×200)

圖6 AR在氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠氣管的表達，免疫組化(×200)

表2 雄激素受體(AR)在各組大鼠肺組織中的表達(±s)

表2 雄激素受體(AR)在各組大鼠肺組織中的表達(±s)

注:與慢支模型組比較:*P<0.05， P<0.01， P<0.001;與正常對照組比較:△P<0.05，△△P<0.01

組別 n 平均灰度 平均光度正 常 對 照 組 12 140.5± 6.04* 0.114±0.015 慢 支 模 型 組 12 134.4± 5.92△ 0.143±0.023△△氣管炎咳嗽痰喘丸組 12 149.9±15.21 0.092±0.034 補腎化痰大劑量組 12 142.2± 9.25* 0.117±0.029*補腎化痰小劑量組 12 143.2± 7.93 0.124±0.016*自 然 恢 復 組 12 135.1± 5.29△ 0.139±0.017△△

圖7 AR在正常對照組大鼠肺內支氣管的表達，免疫組化(×200)

圖8 AR在慢支模型組大鼠肺內支氣管的表達免疫組化(×200)

圖9 AR在自然恢復組大鼠肺內支氣管的表達，免疫組化(×200)

圖10 AR在補腎化痰大劑量組大鼠肺內支氣管的表達，免疫組化(×200)

圖11 AR在在補腎化痰小劑量組大鼠肺內支氣管的表達，免疫組化(×200)

圖12 AR在在氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠肺內支氣管的表達，免疫組化(×200)

圖13 用PBS代替一抗，慢支模型組大鼠氣管中未見AR陽性細胞(陰性對照)，免疫組化(×200)

圖14 用PBS代替一抗，慢支模型組大鼠肺內支氣管中未見AR陽性細胞(陰性對照)免疫組化(×200)

2.3 各組大鼠血清睪酮(T)水平

表3顯示，與正常對照組比較，慢支模型組和自然恢復組大鼠血清T水平顯著下降(P<0.01);與慢支模型組比較，補腎化痰大、小劑量組和氣管炎咳嗽痰喘丸組大鼠血清T水平均明顯升高(P<0.05)，以補腎化痰大劑量組升高幅度最大，自然恢復組大鼠血清T水平雖有上升的趨勢，但無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清睪酮(T)水平(±s)

表3 各組大鼠血清睪酮(T)水平(±s)

注:與慢支模型組比較:*P<0.05， P<0.01;與正常對照組比較:△△P<0.01

組別n T(nmol/L)正 常 對 照 組 12 4.86±2.29 慢 支 模 型 組 12 2.16±1.12△△氣管炎咳嗽痰喘丸組 12 3.30±1.15*補腎化痰大劑量組 12 3.55±1.44*補腎化痰小劑量組 12 3.44±0.96*自 然 恢 復 組 12 2.37±0.97△△

3 討論

近年來，從下丘腦-垂體-性腺軸探討呼吸系統疾病發病機制的研究報道逐漸增多，慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者血清睪酮(T)水平明顯低于正常人;也有研究發現，在正常雄性大鼠的氣管和肺組織中存在雄激素受體(AR)的表達，推測老年人體內雄激素水平降低，通過AR直接影響氣管和肺組織，導致氣管和肺功能減退，可能是老年人慢支發病率顯著高于青年人的主要原因，并且認為雄激素及其受體可能是中醫學“肺腎相關”的物質基礎之一。本研究觀察了補腎化痰中藥對煙熏慢支雄性大鼠氣管和肺組織中AR表達的影響，對于探討從“腎”論治慢支的機理有重要意義。

研究結果顯示，煙熏大鼠慢支模型氣管和肺組織中AR的表達明顯強于正常對照組，血清T水平明顯低于正常對照組。雄激素對AR的調節作用有的為升調節，有的為降調節，因此低水平的雄激素也可能導致AR的高表達。但我們在小鼠的研究中發現，此時睪丸中的AR mRNA表達量是降低的，說明血清雄激素水平的降低并不是導致氣管、肺組織中AR高表達的主要原因。由于香煙煙霧吸入引起氣管中AR高表達的升高程度高于肺組織，由此可以推測，氣管和肺組織中AR的高表達可能主要與香煙中有害物質的直接刺激有關。梁澍等報道，肺癌患者癌組織中AR陽性表達率為61.7%，且AR在肺鱗癌的陽性表達率明顯高于肺腺癌。韓勇等研究顯示，患慢性支氣管炎、肺氣腫病史的 COPD患者，肺癌發生的危險性明顯增高(P<0.05)，因此氣管、肺組織中AR的高表達是否為香煙誘發肺癌的原因之一，值得進一步研究。

自然恢復組大鼠氣管和肺組織中AR的表達量及血清T水平與慢支模型組比較均無顯著性差異，這可能與停止香煙煙霧吸入的時間較短(30d)有關，提示長期吸煙即使戒煙也不能在短時間內完全恢復正常。

補腎化痰中藥是由五子衍宗丸加化痰藥加減而成，五子衍宗液內服可使老年(60歲 ～80歲)腎虛衰老癥狀的總積分值下降，血漿睪酮(T)含量上升，雌二醇(E2)與T比值下降。本研究顯示，由五子衍宗丸化裁而來的補腎化痰中藥能使煙熏大鼠慢支模型已經出現的氣管、肺組織中AR的高水平表達顯著降低，血清T水平明顯升高，推測補腎化痰中藥通過調節雄激素及其受體的表達水平可能是其治療慢支的作用機制之一，同時也提示戒煙后加用補腎化痰中藥能促進其修復，但補腎化痰中藥影響氣管及肺組織AR表達量的具體途徑仍不清楚。

總之，煙熏大鼠慢支模型伴有氣管、肺組織中AR的異常表達，補腎化痰中藥對AR的異常變化有一定治療作用。但AR的異常變化在呼吸系統疾病發病中的作用如何?香煙煙霧通過哪些途徑影響AR的表達?補腎化痰中藥通過哪些環節調節AR的表達等等，均有待進一步研究。

R285.5

B

1006-3250(2010)09-0772-03

河南省杰出青年科學基金資助項目(04120001000)

2010-01-26