環境因素對痹證大鼠自身抗體表達的影響

申洪波，白云靜，胡蔭奇

(1.北京大學第三醫院，北京 100191;2.北京軍區總醫院，北京 100700;3.中國中醫科學院 望京醫院，北京 100102)

環境因素對痹證大鼠自身抗體表達的影響

申洪波1，白云靜2，胡蔭奇3

(1.北京大學第三醫院，北京 100191;2.北京軍區總醫院，北京 100700;3.中國中醫科學院 望京醫院，北京 100102)

目的:研究環境因素對痹證大鼠類風濕關節炎(RA)相關自身抗體表達及關節破壞程度的影響。方法:32只大鼠隨機分為對照組、模型組、寒濕組和濕熱組，除對照組外其余3組造模后給予相應環境刺激。結果:第2、4周時，模型組、寒濕組和濕熱組大鼠血清RF、anti-CCP滴度及 AKA、APF陽性率均明顯高于對照組，4周時 AKA、APF陽性率明顯高于模型組和寒濕組(P均<0.05);濕熱組、寒濕組大鼠骨破壞嚴重。結論:環境因素影響了大鼠RA相關自身抗體表達和關節破壞程度。

類風濕關節炎;自身抗體;環境因素;實驗研究

類風濕關節炎屬中醫痹證范疇，中醫學認為痹證的形成與環境因素密切相關。為研究環境因素與類風濕關節炎相關自身抗體表達的關系，筆者用完全福氏佐劑及人工合成CCP多肽免疫動物，并給予寒濕和濕熱環境刺激，觀察了環境因素對RA相關自身抗體表達的影響以及對RA關節破壞的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組

選取適齡健康雌性SD大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，SCXK(京)2002-0003)32只，依照隨機數字表法隨機分為正常對照組(對照組)、佐劑+CCP抗原組(模型組)、佐劑 +CCP抗原+寒濕環境組(寒濕組)、佐劑+CCP抗原+濕熱環境組(濕熱組)共4組，每組8只。

1.2 主要試劑和儀器

人工合成 CCP多肽，由岳泰公司提供;CCPELISA檢測試劑盒、AKA-ELISA檢測試劑盒、RFELISA檢測試劑盒均由歐盟公司提供;FPQ型多段人工氣候箱，購自寧波萊福科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制作 模型組:使用人工合成的CCP多肽抗原 100μg～150μg與完全福氏佐劑0.1ml混合后，注射一組大鼠雙側后肢足底部制備模型;寒濕組:免疫方法同模型組，并在接受免疫后第2天始，每天置于相對濕度95% ～100%、溫度7℃ ～10℃的環境中2h，連續刺激9d;濕熱組:免疫方法同模型組，并在接受免疫后第2天始，每天置于相對濕度 95% ～100%、溫度 30～33℃的環境中2h，連續刺激9d;對照組不做任何處理。

1.3.2 標本處理 以上各組均于實驗開始2周后尾尖取血1ml制備血清備用;4周后心臟穿刺取血4ml～6ml，制備血清備用;②造模后第4周末處死大鼠，取雙側后肢踝關節，多聚甲醛固定、脫鈣、脫水、浸臘、包埋、切片，HE染色后以備鏡下觀察。

1.3.3 觀察指標 雙側后肢跖趾厚度:使用千分卡尺分別測量大鼠雙側后肢跖趾厚度，取其雙側平均值。類風濕相關自身抗體檢測:包括類風濕因子(RF)(ELISA法)、抗角蛋白抗體(AKA)(間接免疫熒光法)、抗核周因子(APF)(間接免疫熒光法)、抗環瓜氨酸多肽抗體(anti-CCP)(ELISA法)。病理學檢測:HE染色后鏡下觀察大鼠踝關節的關節結構變化情況。

圖1 大鼠后肢踝關節HE染色濕熱組

圖2 大鼠后肢踝關節HE染色寒濕組

圖3 大鼠后肢踝關節HE染色模型組

圖4 大鼠后肢踝關節HE染色對照組血清AKA表達情況

1.4 統計分析方法

所有資料均采用SAS8.0統計軟件進行分析，等級資料采用秩和檢驗和ridit分析，計量資料用方差分析，各時間點比較采用具有一個重復測量的兩因素方差分析。

2 觀察結果

2.1 各時間點大鼠雙側后肢跖趾平均厚度比較

表 1 顯示，實驗各組在實驗前、6d、12d、18d、24d、28d等6個時間點大鼠雙側后肢跖趾厚度比較顯示，實驗前各組跖趾厚度無顯著性差異(P>0.05);其余5個時間點各組均值之間比較均有統計學意義(P均<0.01)。組間兩兩比較顯示:從第6天開始，模型組、寒濕組和濕熱組在各個時間點均明顯高于對照組(P均<0.01);從第24天開始，寒濕組和濕熱組在各個時間點也均高于模型組(P均<0.05);但濕熱組和寒濕組之間無顯著性差異(P均>0.05)。組內兩兩比較顯示:對照組各個時間點之間均無顯著性差異(P均 >0.05);模型組第6天及以后的各個時間點均明顯高于觀察前(P均<0.01)，其余各個時間點之間無顯著性差異(P均>0.05);寒濕組第6天及以后的各個時間點均明顯高于觀察前(P均<0.01)，第28天分別高于第6天和第12天(P均<0.05)，其余各個時間點之間無顯著性差異(P均>0.05);濕熱組第6天及以后的各個時間點均明顯高于觀察前(P均<0.01)，第28天分別高于第6天和第12天(P均<0.05)，其余各個時間點之間無顯著性差異(P均>0.05)。

2.2 血清RF和抗CCP檢測結果

表2顯示，實驗2周末、4周末模型組、寒濕組和濕熱組大鼠血清RF水平均明顯高于對照組(P均<0.05);2周末寒濕組和濕熱組又均明顯高于模型組(P均<0.05)，但寒濕組和濕熱組之間差異無統計學意義(P>0.05);4周末模型組、寒濕組和濕熱組比較無統計學差異(P均>0.05)。

表2顯示，實驗2周末、4周末模型組、寒濕組和濕熱組大鼠血清CCP抗體滴度均明顯高于對照組(P均<0.05);2周末、4周末寒濕組和濕熱組又均明顯高于模型組(P均<0.05)，但寒濕組和濕熱組之間差異無統計學意義(P均>0.05)。

表 1 實驗前、6d、12d、18d、24d、28d 各組跖趾厚度檢測結果(mm，±s)

表 1 實驗前、6d、12d、18d、24d、28d 各組跖趾厚度檢測結果(mm，±s)

注:與對照組比較:★P<0.01;與模型組比較:▲P<0.05;與觀察前比較:■P<0.01;與第6天比較:#P<0.05;與第12天比較:◇P<0.05

時間(d)對照組(8) 模型組(8) 寒濕組(8) 濕熱組(8)實驗前4.35±0.24 4.52±0.15 4.46±0.29 4.35±0.34 6 4.43±0.25 6.76±0.99★■ 6.55±1.32★■ 6.63±0.82★■12 4.54±0.20 6.21±0.52★■ 6.50±0.31★■ 6.88±0.62★■18 4.61±0.29 7.11±0.75★■ 7.39±0.59★■ 7.48±0.33★■24 4.63±0.24 6.42±0.83★■ 7.39±0.44★▲■ 7.50±0.46★▲■28 4.89±0.27 6.40±0.33★■ 7.91±0.74★▲■#◇ 7.83±0.43★▲■#◇

表2 RF和抗CCP表達情況

圖5 濕熱組AKA(+++)

圖6 寒濕組AKA(++)

圖7 模型組AKA(+)

圖8 對照組AKA(－)

2.3 血清AKA表達情況檢測結果

表3顯示，實驗2周末、4周末，模型組、寒濕組和濕熱組大鼠血清AKA的陽性率均明顯高于對照組(P均<0.05);4周末濕熱組血清AKA陽性率明顯高于模型組和寒濕組(P均<0.05)，但寒濕組和濕熱組之間無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 血清APF表達情況檢測結果

表4顯示，實驗2周末、4周末，模型組、寒濕組和濕熱組大鼠血清APF的陽性率均明顯高于對照組(P均<0.05);4周末濕熱組血清APF陽性率明顯高于模型組和寒濕組(P均<0.05)，但寒濕組和濕熱組之間無顯著性差異(P>0.05)。

注:與對照組比較:★P<0.05;與模型組比較:▲P<0.05;與寒濕組比較:#P<0.05

表4 2周末、4周末APF表達情況

2.5 病理學檢測結果

對照組:關節結構正常，滑膜組織無炎性細胞浸潤，滑膜細胞無增生，骨及軟骨結構正常;模型組:關節結構基本正常，滑膜細胞輕度增生，骨及軟骨結構基本正常;寒濕組:滑膜組織增生，可見3～4層排列不規則的滑膜細胞及炎性細胞浸潤，骨小梁稀疏，髓腔擴大;濕熱組:滑膜細胞增生明顯，可見數層排列不規則的滑膜細胞及炎性細胞浸潤，骨小梁稀疏、斷裂，排列不規則。

3 討論

中醫學認為，人體是一個有機整體，人和環境之間相互影響，也是一個不可分割的有機整體。《素問·六節臟象論》曰:“天食人以五氣，地食人以五味，五氣入鼻，藏于心肺，上使五色修明，音聲能彰;五味入口，藏于腸胃，味有所藏，以養五氣，氣和而生，津液相成，神乃自生。”《素問·寶命全形論》云:“人以天地之氣生，四時之法成”，說明自然環境乃人類生命賴以生存的源泉，同時人類作為整個物質世界的一部分，時刻受到自然環境變化的影響。正如《靈樞·邪客論》所言:“此人與天地相應者也。”類風濕關節炎屬中醫痹證范疇，正如《黃帝內經素問·痹論》中所說“風寒濕三氣雜至合而為痹也，其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹。”可見，痹病與環境的關系尤為明顯。現代醫學認為，雖然RA的病因在很大程度上還不明確，然而RA很可能是一種多因子疾病包括遺傳因素和環境因素。甚至有的學者認為，在RA發病過程中環境因素起了至關重要的作用，這種作用甚至超過遺傳因素。近年來隨著免疫學的進展，類風濕關節炎相關自身抗體的發現，對類風濕關節炎的早期診斷和預后都有很大幫助。多數學者認為，anti-CCP、APF、AKA的表達與類風濕關節炎關節破壞程度有關。然而，類風濕關節炎自身抗體的表達與中醫證候之間的關系如何?環境因素是否影響類風濕關節炎自身抗體的表達?本實驗在佐劑性關節炎模型的基礎上，用人工合成 CCP多肽抗原免疫動物，結合環境因素制作動物模型，觀察了不同環境下動物模型自身抗體表達的情況及關節破壞程度。

本研究顯示，①造模從實驗第6天起對大鼠后肢跖趾厚度具有非常顯著性影響，濕熱和寒濕環境更加重了對大鼠后肢跖趾厚度的影響，且隨著時間的推移，這種影響逐漸加重，但濕熱和寒濕環境之間無顯著性差異;②造模加寒濕或濕熱環境刺激能使大鼠血清RF水平顯著升高，但濕熱與寒濕環境之間比較無統計學差異;③造模加寒濕或濕熱環境刺激能使大鼠血清CCP抗體滴度顯著升高，但濕熱與寒濕環境之間比較無統計學差異;④造模或造模加寒濕或濕熱環境刺激均能使大鼠血清AKA、APF陽性率明顯高于對照組，其中造模加濕熱環境的陽性率最高，造模加寒濕環境次之，但與單純造模無顯著性差異;⑤病理 HE染色顯示，模型組、寒濕組和濕熱組均可見關節滑膜細胞增生及炎性細胞浸潤，其中模型組最輕，濕熱組關節破壞最重，可見數層排列不規則的滑膜細胞及炎性細胞浸潤，寒濕組介于2組之間，

上述研究提示，寒濕和濕熱等環境因素影響了動物模型血清中 RF、anti-CCP、APF、AKA 的表達，加重了動物模型的自身免疫反應和關節炎的嚴重程度，其中濕熱環境的影響更為明顯。濕熱組關節破壞最重，RF、anti-CCP、APF、AKA 的表達均顯著增高或表達強陽性，特別是AKA和APF表達與關節破壞程度有關。從中可得出結論，寒濕和濕熱環境因素明顯影響了大鼠佐劑性關節炎的發病及嚴重程度，促進了疾病的發生，并加重了關節炎的病理進程。

本實驗顯示，寒濕和濕熱環境對大鼠跖趾厚度、自身抗體表達及關節破壞程度均有明顯影響，其中濕熱環境對大鼠血清AKA和APF影響及對關節破壞程度的影響更為嚴重，原因尚不清楚。但我們在實驗過程中發現，在寒濕環境中大鼠經常簇擁在一起取暖，這可能減緩了寒濕環境對其發病的影響，所以究竟寒濕和濕熱環境對RA發病的影響孰輕孰重，兩種環境對RA相關自身抗體表達的影響有何不同，兩種環境下的動物模型與中醫濕熱證和寒濕證是否一致，還有待進一步研究。

Effect of Environmental Factors on Expression of Autoantibody in Rats with Bi-Syndrome(Arthromyodynia)

SHEN Hong-bo1，BAI Yun-jing2，HU Yin-qi3
(1.Peking university third hospital，Beijing100191，China;2.The military general hospital of Beijing PLA，Beijing100700，China;3.Wangjing hospital of China academy of Chinese medical science，Beijing100102，China)

Objective:To study the impact of environmental factors on expression of autoantibodies in arthragia syndrome rats.Methods:32 SD rats were randomly divided into control group，model group，damp-cold group or damp-heat group.In addition to the control group，the other 3 groups after modeling were put into different environmental for stimuli.Results:Compared with model group，the RF，APF and anti-CCP levels of both damp-heat group and damp-cold group showed statistically significant increase(P<0.05)，after both two and four weeks.Two weeks later，compared with model group，the AKA level of both damp-cold and damp-heat group showed statistically significant increases(P<0.05).4 weeks later，the AKA level had statistically significant increase compared with not only model group but also damp-cold group(P<0.05).The pathological results(4 weeks later)illustrated that the joint damage of rats from both damp-heat and damp-cold group were severer than that from model group and the joint damage of rats from damp-heat group were obviously the most serious.

rheumatoid arthritis，autoantibody，environmental factors，experimental study

R593.22

B

1006-3250(2010)09-0832-03

2010-03-17

申洪波(1966-)，男，山東濰坊人，醫學博士，主治醫師，從事中醫藥治療風濕免疫性疾病的臨床和實驗研究。Tel:010-82266267，18601227122，E-mail:shenhbo@yahoo.com.cn。