紅景天對卒中后抑郁大鼠海馬細胞因子干預作用的實驗研究*

隋汝波，張 磊，臧麗娥

(1.遼寧醫學院附屬第一醫院 神經內科，遼寧 錦州 121001;2.遼寧醫學院，遼寧 錦州 121001)

紅景天對卒中后抑郁大鼠海馬細胞因子干預作用的實驗研究*

隋汝波1△，張 磊2，臧麗娥1

(1.遼寧醫學院附屬第一醫院 神經內科，遼寧 錦州 121001;2.遼寧醫學院，遼寧 錦州 121001)

目的:探討紅景天對卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)大鼠海馬細胞因子的干預作用。方法:各組進行行為學觀察和測試、海馬組織HE染色及TNF-α、IL-1β、IL-6含量測定。結果:與PSD組比較，紅景天低、中、高劑量組均能不同程度減少海馬組織TNF-α、IL-1β含量而提高IL-6的含量，減少海馬神經細胞的受損程度，提高抑郁的行為學評分。其中，中、高劑量組較低劑量組作用更明顯。結論:PSD大鼠海馬組織細胞因子網絡穩態發生改變，紅景天對PSD大鼠海馬有保護作用。

卒中后抑郁;海馬;細胞因子;紅景天

PSD是腦卒中后的一個常見的并發癥，顯著增加了卒中患者的病死率、致殘率，降低了患者的生存質量，給患者及其家庭乃至社會帶來了十分沉重的負擔，已越來越引起學者的關注。目前雖已有各種藥物用于臨床，但療效均不理想，無效率仍高達20%～40%［1］。近年的研究提出海馬損傷及炎癥因素參與了PSD的發生發展，故如果能減少PSD時的海馬損傷及穩定細胞因子網絡，將能夠有效治療PSD。

紅景天已有多年臨床應用經驗，在治療缺血性心臟病及缺血性腦血管病等方面已取得了良好療效。對其在 PSD中的作用國內報道少見，而其對PSD時海馬組織細胞因子的影響更尚未見報道。本文根據紅景天免疫雙向調節功能的中醫理論，觀察其對大鼠PSD時海馬組織細胞因子 TNF-α、IL-6及IL-1β水平的影響，以及海馬組織的改變及其對PSD大鼠行為學的影響，從而為PSD的治療提供新的思路及理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用健康普通級雄性SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠 60 只，體重 180g～240g，遼寧醫學院實驗動物中心提供，許可證號 SCXK(遼)。

1.1.2 藥品和試劑 紅景天購于吉林白山市藥材責任有限公司，IL-1β、TNF-α、IL-6試劑盒購自天津千葉生物技術有限公司。

1.1.3 儀器 DH-I型動物人工呼吸機:浙江醫科大學儀器試驗廠;低速離心機:北京醫用離心機廠;BH6018型四探頭自動r計數器:北京核儀器廠;電子天秤:上海天平儀器廠;連續變倍體視顯微鏡160x:桂林儀器廠;石英自動雙重純水蒸餾器:江蘇丹陽門石英玻璃廠;LEICA-RM-2135石蠟切片機:德國;烘片、烤片機:孝感市電子儀器廠;OLYMPUS萬能顯微鏡:日本;CIAS-1000型 T圖像分析儀:北京大恒圖像視覺有限公司;電熱干燥箱:余姚工業儀表二廠。

1.2 方法

1.2.1 分組 遵循隨機原則，將72只大鼠分為單純缺血組、PSD組、氟西汀組和3個劑量的紅景天組，每組12只。紅景天組紅景天分別按生藥2.5g/kg/d、5g/kg/d、7.5g/kg/d 溶于 2 ml生理鹽水中，灌胃給藥21d，余各組每天以同樣給藥途徑給予等劑量的生理鹽水，灌胃21d。

1.2.2 大鼠局灶性腦缺血模型的建立［2］

(middle cerebral artery occlusion，MCAO)手術前 12h禁食不禁水。選用標準大鼠麻醉劑量，以10%水合氯醛3ml·kg－1，經腹腔麻醉，仰臥固定于手術臺上，頸部正中切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露左側頸總動脈(CCA)和迷走神經、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)、ICA的顱外分支——翼腭動脈，在近心端結扎 CCA，在頸總動脈分叉處結扎ECA，結扎翼腭動脈。將ICA遠心端用動脈夾夾閉，距頸總動脈分叉處近心端0.5cm處將頸總動脈剪一小口，插入備好的碳素魚線，去除動脈夾，沿著ICA輕輕向前推進，注意不要誤入翼鄂動脈，當到達指定長度(18 mm左右)時結扎ICA并固定魚線。假手術組動物，除手術過程中不插入線栓以外，其他過程相同。以青霉素局部消毒后縫合皮膚，術后保持環境溫度在25℃ ～30℃左右。尤其要注意動物頭部的保溫。模型成功的標志是大鼠即刻出現右側Horner征。

1.2.3 大鼠卒中后抑郁模型的制備 CUMS:按willner和 Katz方法:①禁食禁水 20h;②禁水17h;③傾斜鼠籠45°17h;④持續光照17h;⑤濕籠(100g鋸屑+200ml水)21h;⑥4℃游泳 5min;⑦水平搖晃5min;⑧行為限制2h;⑨夾尾1min 9種刺激每天隨機采取1種共21d;⑩孤養:將PSD和抑郁組動物單籠飼養。

1.2.4 行為學觀察和測試 CUMS后第1、7、14、21天行曠野實驗測試，每周行蔗糖水實驗并測量體重。(1)曠野實驗:室內隔音，測定5min水平及垂直運動得分;(2)蔗糖水實驗:20h禁食禁水后，測定1h糖水飲用比例(糖水消耗/總液體消耗 ×100%);(3)體重測量:每周測量各組體重。

1.2.5 HE染色 大鼠以10%水合氯醛(0.3ml.100mg－1)腹腔注射麻醉，打開頸部暴露頸右總動脈，插管，先輸注生理鹽水約50ml，然后輸注4%多聚甲醛約50ml，斷頭取腦。甲醛固定，冠狀腦片制備，選擇梗死中心(即最大層面)，常規酒精脫水，石蠟包埋，制成 4μm ～6μm 厚的切片，附片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，分別觀察梗死中心區、梗死周邊區腦組織(海馬CAl、CA3區)，前述區域神經細胞和血管內皮細胞(每個觀察區選擇具有代表性標本觀察結果并記錄)。

1.2.6 放射免疫法檢測海馬組織IL-1β、TNF-α、IL-6的含量 21d后各組每只分別迅速斷頭，剝離出腦，在冰浴下迅速分離海馬組織，制備組織勻漿，3000r/min離心15min，吸取上清液采用放射免疫分析法檢測細胞因子，實驗按說明書操作。

1.2.7 統計學處理 實驗數據計量資料均用均數±標準差(±s)表示，采用SPSS16.0統計軟件進行單因素方差分析。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異非常顯著。

2 結果

2.1 大鼠行為學觀察和測試

表1 各組PSD大鼠體重比較(±s，g)

表1 各組PSD大鼠體重比較(±s，g)

注:經方差分析與兩兩比較，與假手術組比較:aP>0.05，bP<0.01，cP<0.05;與單純缺血組比較:dP>0.05，fP<0.01;與 PSD組比較:eP<0.05，gP>0.05，iP<0.01;與低劑量組比較:jP>0.05，kP<0.05，lP<0.01;與氟西汀組比較:nP>0.05，rP<0.05;與中劑量組比較:mP>0.05

組別第1天 第7天 第14天 第21天假 手 術 組 278.7±22.5 279.6±23.8 293.7±20.9 304.6±25.8單 純 缺 血 組 279.4±28.3a 289.7±26.2a 307.5±27.2b 311.4±26.6c PSD 組 284.5±23.2d 285.9±25.1d 266.1±12.1f 261.0±21.7f氟 西 汀 組 281.3±21.3g 281.0±21.5g 297.2±26.3i 311.2±22.1i紅 景 天 低 劑 量 組 278.5 ±27.4g，n 279.4 ±20.3g，n 281.3 ±23.7e，r 285.2 ±31.7e，r紅 景 天 中 劑 量 組 279.7 ± 23.7g，j，n 280.0 ± 30.9g，j，n 296.8 ± 21.5i，k，n 306.9 ± 27.5i，k，n紅 景 天 高 劑 量 組 281.6 ± 20.6g，j，n，m 279.7 ± 25.9g，j，n，m 295.1 ± 23.5i，l，n，m 310.8 ± 22.9i，l，n，m

表2 各組PSD大鼠糖水消耗量比較(±s，ml)

表2 各組PSD大鼠糖水消耗量比較(±s，ml)

注:經方差分析與兩兩比較，與假手術組比較:bP<0.05，cP>0.05;與單純缺血組比較:fP<0.01;與 PSD組比較:gP>0.05，eP<0.05，iP<0.01;與低劑量組比較:jP>0.05，hP<0.05，lP<0.01;與氟西汀組比較:nP>0.05，rP<0.05;與中劑量組比較:mP>0.05

組別第1天 第7天 第14天 第21天假 手 術 組39.4±5.5 40.6±4.3 38.6±4.7 38.8±4.6單 純 缺 血 組 34.6±8.5c 38.3±6.2c 35.6±4.3c 30.3±4.4b PSD 組 23.7±6.3f 20.5±3.9f 17.6±9.0f 10.5±3.4f氟 西 汀 組 23.9±4.5g 25.2±5.2g 31.1±6.3e 33.2±3.6i紅 景 天 低 劑 量 組 22.4 ±4.9g，n 23.0 ±6.5g，n 25.6 ±2.6e 27.6 ±7.7i，n紅 景 天 中 劑 量 組 23.7 ± 2.6g，j，n 25.0 ± 7.9g，j，n 29.8 ± 6.5e，h，n 34.9 ± 3.5i，l，n紅 景 天 高 劑 量 組 22.6 ± 5.0g，j，n，m 24.7 ± 3.5g，j，n，m 30.1 ± 6.2e，h，n，m 32.8 ± 4.9i，l，n，m

表3 各組PSD大鼠曠野實驗水平運動得分比較(±s，次/5min)

表3 各組PSD大鼠曠野實驗水平運動得分比較(±s，次/5min)

注:經方差分析與兩兩比較，與假手術組比較:cP<0.01;與單純缺血組比較:fP<0.01;與 PSD組比較:gP>0.05，iP<0.01;與低劑量組比較:jP>0.05，lP<0.05，kP<0.01;與氟西汀組比較:nP>0.05，rP<0.05;與中劑量組比較:mP>0.05

組別第1天 第7天 第14天 第21天假 手 術 組51.3±4.5 6.4±3.1 58.2±2.9 59.6±5.2單 純 缺 血 組 43.4±7.5c 48.3±4.2c 44.6±5.3c 41.3±4.6c PSD 組 29.7±2.3f 23.5±2.3f 19.6±1.9f 15.5±2.4f氟 西 汀 組 28.3±3.2g 28.9±3.2g 39.3±2.1i 39.1±1.3i紅 景 天 低 劑 量 組 27.4 ± 2.6g，n 28.0 ±1.9g，n 29.6 ±2.1i，r 30.6 ± 1.7i，r紅 景 天 中 劑 量 組 28.7 ± 1.6g，j，n 29.4 ± 3.0g，j，n 38.8 ± 0.5i，l，n 38.9 ± 1.5i，k，n紅 景 天 高 劑 量 組 27.6 ± 4.6g，j，n，m 28.7 ± 0.5g，j，n，m 36.1 ± 2.5i，l，n，m 37.8 ± 2.6i，l，n，m

表1～3顯示，與單純缺血組相比，PSD組大鼠體重和糖水消耗量下降，水平運動及垂直運動水平降低(P<0.01);氟西汀組大鼠體重和糖水消耗量增多，水平運動及垂直運動水平提高(P<0.01);紅景天各組均可以增加PSD大鼠體重和糖水消耗量，提高水平運動及垂直運動水平，其中中、高劑量組較低劑量組效果更明顯 (P<0.01)，但2組間無明顯差異(P>0.05)。且中、高劑量紅景天組與氟西汀組相比，無明顯差異(P>0.05)。

2.2 海馬CA1區腦組織病理形態學

HE染色(×400)光學顯微鏡下觀察，每組均可見正常神經元和損傷神經元。正常神經元核圓形，邊界及核仁清楚;損傷神經元胞核腫大、偏位，核仁消失，胞漿著色淺、蒼白或核濃縮、深染，細胞呈三角形缺血性壞死變化。損傷神經元上述特點在PSD組表現得最明顯;紅景天組與氟西汀組均能不同程度地改善神經細胞的核深染、核固縮程度，減少細胞及間質的水腫，使胞膜清楚、形態正常、核仁清晰可見的神經細胞數目增多。

2.3 海馬組織 TNF-α、IL-1β、IL-6的含量

表4顯示，與單純缺血組相比，PSD組 TNF-α、IL-1β含量明顯增加而 IL-6的含量下降，差異有統計學意義(P<0.01);與PSD組相比，氟西汀組與紅景天各組均降低 TNF-α、IL-1β的含量而提高 IL-6含量(P<0.01);其中，中、高劑量組較低劑量組效果更明顯(P<0.05)，2組間無明顯差異(P>0.05)。而中、高劑量紅景天組與氟西汀組相比，無明顯差異(P>0.05)。

表4 各組PSD大鼠海馬組織細胞因子含量比較(±s，)

表4 各組PSD大鼠海馬組織細胞因子含量比較(±s，)

注:經方差分析與兩兩比較，與假手術組比較:bP<0.05，與單純缺血組比較:fP<0.01;與 PSD組比較:iP<0.01;與低劑量組比較:kP<0.05，lP<0.01;與氟西汀組比較:nP>0.05，rP<0.05;與中劑量組比較:mP>0.05

組別 TNF-α(ng/ml) IL-1β(pg/ml) IL-6(pg/ml)假 手 術 組0.69±0.3 0.17±0.4 152.50±3.7單 純 缺 血 組 0.95±0.1b 0.28±0.1b 121.80±7.7b PSD 組 1.66±0.3f 0.83±0.2f 80.30±5.9f氟 西 汀 組 1.02±0.3i 0.32±0.4i 138.40±6.2i紅 景 天 低 劑 量 組 1.27 ± 0.1i，r 0.62 ± 0.6i，r 113.60 ± 5.8i，r紅 景 天 中 劑 量 組 1.15 ± 0.5i，l，n 0.48 ± 0.3i，l，n 128.90 ± 1.5i，k，n紅 景 天 高 劑 量 組 1.09 ± 0.2i，l，n，m0.37 ± 0.5i，l，n，m 137.80 ± 0.9i，l，n，m

3 討論

3.1 PSD的發病機制仍不明確，多種學說并存

研究證實，中度抑郁患者海馬體積減少，并可被抗抑郁藥逆轉，從而提出了海馬神經再生障礙假說。近年來有研究顯示，細胞因子網絡的異常有可能參與PSD的發生。多項實驗證明，IL-6延遲性表達對缺血再灌注后海馬神經元有保護作用，抑制IL-1β及TNF-α的合成，對抗谷氨酸引起的細胞損傷。而TNF-α及IL-1β對缺血再灌注后海馬神經元有損傷作用，具體機制還需進一步研究。以卒中后炎癥反應為基礎，最近Robinson等提出了關于PSD病因學的新假說，即細胞因子假說。他們認為，細胞因子與5-HT通過吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO酶)的相互作用可能在PSD中起重要作用:卒中后炎性細胞因子(如IL-1β，TNF-α)增多導致炎癥過程的增強(尤其是邊緣區)和IDO酶的廣泛激活，并繼發旁邊緣結構如前側額皮質和基底節的5-HT的耗竭。Tara等在大鼠模型中的研究發現，側腦室灌注IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)可以逆轉大鼠的 PSD樣行為，表明PSD可能涉及腦內IL-1傳遞的改變。與單純卒中相比，PSD患者可能有致炎性細胞因子水平的進一步升高或高峰持續時間延長，或抗炎性細胞因子水平的降低或反應性升高的延遲，即PSD患者體內可能存在著細胞因子網絡穩態的失衡。給予抗炎性細胞因子或抗抑郁治療后，患者可能出現炎性細胞因子水平降低或抗炎性細胞因子水平升高，細胞因子網絡重新達到穩態，進而減少對海馬的損傷，改善患者抑郁癥狀。

3.2 紅景天是近年來新開發的高山藥用植物，已有多年臨床應用經驗，在治療缺血性心臟病及缺血性腦血管病等方面已取得了良好療效

文獻報道，它能在極其惡劣而多變的自然環境中生長，具有扶正固本、益氣化瘀、抗缺氧、增強免疫功能及雙向調節等功效。已證實，紅景天內含 Cu-Zn-SOD與Mn-SOD，是重要的超氧自由基清除劑，直接提供并增加SOD水平。它能促使血管內皮細胞產生NO，有效抑制ADP誘導的血小板聚集，改善血小板功能，恢復纖溶活性，抗體外血栓形成。而其強大的免疫雙向調節功能又為其直接降低某些致炎性細胞因子水平，增加抗炎性細胞因子水平，從而穩定細胞因子網絡提供了理論上的可能依據。

3.3 本實驗研究著眼于對PSD大鼠行為學的觀察和測試、海馬組織 TNF-α、IL-1β、IL-6含量的測定及海馬CA1區病理形態學的觀察

與單純缺血組相比，PSD時海馬損傷與細胞因子網絡改變顯著增加。紅景天各組均可以明顯改善PSD的抑郁行為學特征及海馬組織神經元損傷程度，顯著減低海馬組織的細胞因子 TNF-α、IL-1β水平，而同時提高 IL-6的含量。上述改變尤以中、高劑量紅景天組顯著，可以說明紅景天對PSD具有保護作用。紅景天降低細胞因子水平的作用機制不明，可能與其免疫雙向調節功能有關，即維持體內免疫系統處于平衡狀態:既能提高免疫功能，又能防止免疫系統的矯枉過正，從而穩定細胞因子網絡的平衡;既阻止致炎性細胞因子的過度生成，同時又防止抗炎性細胞因子的過度減少。通過穩定細胞因子網絡的平衡，進而減少海馬組織的損傷，達到治療PSD的目的。

［1］江開達.抑郁障礙防治指南［M］.北京:北京大學醫學出版社，2007.1-6.

［2］陳佳俊，石巖殊，韓雪梅，等.線拴法大鼠局灶性腦缺血模型(PMCAO)的實驗研究［J］.吉林醫學，2004，25(10):16-17.

R285.5

B

1006-3250(2010)09-0816-03

遼寧省教育廳高等學校科學研究項目(2008406)

2010-03-08

隋汝波(1971-)，男，副主任醫師，醫學碩士，碩士研究生導師，從事腦血管病方面的研究。

△通訊作者:隋汝波。Tel:13940653533，E-mail:suirubo 521@yahoo.com.cn。