復方維生素注射液（4）細菌內毒素檢查法的建立

胡守蓮，李道明

（河南省信陽市食品藥品檢驗所，河南信陽 464000）

復方維生素注射液（4）細菌內毒素檢查法的建立

胡守蓮，李道明

（河南省信陽市食品藥品檢驗所，河南信陽 464000）

目的：建立復方維生素注射液（4）細菌內毒素檢查的方法。方法：用兩個生產廠家的鱟試劑對兩個廠家6個批號的復方維生素注射液（4）分別進行干擾實驗，考察確立該品種細菌內毒素的檢測方法。結果：復方維生素注射液（4）對細菌內毒素檢查有干擾作用，但稀釋100倍以上可消除。結論：可以用細菌內毒素檢查法（凝膠法）代替家兔熱原檢查法控制其熱原。其細菌內毒素限值為50 EU/ml。

復方維生素注射液（4）；鱟試劑；細菌內毒素；干擾試驗

復方維生素注射液（4）為維生素類藥物，是機體維持正常代謝和功能所必需的一類低分子化合物。其多數由食物提供，少數可在體內合成或由腸道細菌產生[1]，主要用于大面積及嚴重創傷者、外科疾病伴有腸功能障礙者(如腸瘺、短腸綜合征)、危重患者中較長時間不能進食者。靜脈滴注給予維生素能對危重患者起到維持、延長和挽救生命的作用，對正常進食或超高代謝的患者起到糾正負氮平衡，促進傷口愈合，增加體重以及提高存活率的作用[2]。本品現行標準為國家食品藥品監督管理局藥品標準YBH19942005[S]，該標準項下以熱原（家兔法）檢查來控制熱原質。由于家兔法操作比較繁瑣，環境要求高，成本比較大，而細菌內毒素檢查法具有靈敏快速、簡便易行、經濟實用等優點，故筆者參照《中國藥典》2005年版二部附錄XI E細菌內毒素檢查法 （BET）[2-4]的要求，對采用細菌內毒素檢查法（凝膠法）對復方維生素注射液（4）進行檢測的可行性進行探討。

1 材料與儀器

復方維生素注射液（4）[規格 2 ml，批號：080926、090320、080926，陜西秦光制藥廠；規格 2 ml，批號：0905301、0804181、0804171，四川美大康佳樂藥業有限公司。實驗前熱原檢查均符合規定）。內毒素工作標準品（WSE）（中國藥品生物制品檢定所，批號：2009-10，每支 100 EU）。 鱟試劑（TAL）（湛江安度斯生物有限公司，批號：0911220，規格 0.1 ml，靈敏度0.25 EU/ml；湛江博康海洋生物有限公司，批號：0906020，規格0.1 ml，靈敏度0.25 EU/ml）。細菌內毒素檢查用水（BET水）（中國藥品生物制品檢定所，批號 W2009－3，每支 10 ml）；電熱恒溫水浴箱（北京市醫療設備廠）。2H-2自動旋渦混合儀（天津藥典標準儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度的復核

按照《中國藥典》2005年版二部細菌內毒素檢查法項下的規定進行[4]，結果（見表 1）：鱟試劑靈敏度在 0.5～2.0 λ 之間，結果符合規定。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結果

2.2 內毒素限值的確定

根據公式L=K/M，L為樣品的細菌內毒素限值；K為按規定的給藥途徑，人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑為5 EU/(kg·h)；M為人每千克體重每小時用藥最大劑量；本品人用每次最大劑量為2 ml（加入500 ml葡萄糖、氯化鈉、氨基酸等輸液中靜脈滴注），即M＝2/60＝1/30 ml/(kg·h)（人均體重按 60 kg 計），則 L＝K/M=5/（1/30）=150 EU/ml。 為提高質量標準，保證人體用藥安全，把L值定為50 EU/ml.

2.3 干擾試驗

2.3.1 干擾預試驗 由于本品的L值定為50 EU/ml,所以對應于市場常見的鱟試劑（靈敏度為0.50～0.03 EU/ml），按照公式MVD＝CL/λ 計算，得到系列有效稀釋度的樣品液，即 1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600。采用靈敏度 λ＝0.25 EU/ml的鱟試劑，將樣品用 BET 水配制成 1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400 的5個系列濃度，作為供試品液（NPC），并配制此系列稀釋液分別含2 λ的供試品陽性液（PPC），分別將NPC和PPC兩個系列的樣品液與鱟試劑反應（37℃，60 min）[5]，結果見表2。

表4 復方維生素注射液（4）的細菌內毒素檢查結果

表2 預干擾實驗測定結果

2.3.2 干擾實驗 用BET水和1∶200的樣品稀釋液將WSE稀釋成 0.500、0.250、0.125、0.062 EU/ml的 2 個系列濃度，并與兩個廠家的TAL反應，實驗重復4管，結果顯示兩個系列的內毒素溶液反應終點濃度均在0.5～2.0 λ之間[6]。見表3。

表3 復方維生素注射液（4）干擾實驗結果

2.4 復方維生素注射液（4）的細菌內毒素檢查

取兩個廠家生產的復方維生素注射液（4）各3批（陜西秦光制藥廠，規格：2 ml，批號：080926、090320、080926；四川美大康佳樂藥業有限公司，規格：2 ml，批號：0905301、0804181、0804171），分別用 BET 水配制成 1∶200 的稀釋液，用兩個廠家生產的靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑，按照《中華人民共和國藥典》2005年版二部細菌內毒素檢查法[4]依法檢查。結果見表4。

3 討論

為初步確定復方維生素注射液（4）對鱟試劑凝集反應的影響，確定最大不干擾濃度，正式實驗前進行了干擾實驗的預實驗[7-9]，試驗結果表明復方維生素注射液（4）對細菌內毒素檢查有干擾作用，但稀釋100倍以上可消除。

為進一步考察供試品對鱟試劑是否存在干擾作用，筆者采用兩個廠家的鱟試劑（靈敏度均為0.25 EU/ml），兩個廠家的6批樣品進行了正式干擾試驗，結果表明樣品在最大稀釋濃度（200倍）不干擾實驗，可依該方法進行檢測。

用兩個廠家鱟試劑分別與兩個廠家的6批樣品進行細菌內毒素檢查，其結果均符合規定，這與熱原檢查的結果一致。

本試驗的結果表明采用鱟試劑法（凝膠法）代替傳統的家兔法對復方維生素注射液（4）的熱原質進行控制是完全可行的，其內毒素限值為50 EU/ml。

[1]陳新謙.新編藥物學[M].16版.北京:人民衛生出版社,2007:683．

[2]劉羽,劉燕,王賀,等.HPLC法測定復方維生素注射液(4)中4種成分的含量[J].安徽醫藥,2009,13(8):895-897.

[3]石慶平,丁峰,郭輝.復方維生素注射液(4)細菌內毒素檢查方法的建立[J].安徽醫藥,2006,39(1):96-98.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.北京:化學工業出版社,2005:附錄 85-88.

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[6]隋妍蕾,張建國,李常娥.維生素C注射液的細菌內毒素檢查法[J].中國藥業,2000,9(2):29-30.

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Establish of the Bacterial Endotoxins Test of Compound Vitamin(4)Injection

Objective:To establish the BacterialEndotoxins Test of Compound Vitamin(4)Injection.Methods:The interference test of 6 batches of samples with 2 limulus test agents was carried out.Results:There was interference effect of Compound Vitamin(4)Injection on the reaction of bacterial endotoxin and tachypleus amebocyte lysate.But the interference can be neutralized by diluting the solution concentration to 1∶100.Conclusion:These results suggest that the Bacterial Endotoxins Test can be used for the detection of endotoxin in Compound Vitamin(4)Injection instead of pyrogen test,and its endotoxin limit concentration can be established as less than 50 EU/ml.

Compoundvitamin(4)injection;Limulus test agent;Bacterial endotoxins test;Interference test

R977.2

B

1674-4721（2010）09（b）-044-02

胡守蓮，女，主管藥師，主要從事藥品檢驗。

HU Shoulian,LI Daoming

(Institute for Food and Drug control of Henan Xinyang,Xinyang 464000,China)

2010-07-07）