胃腸舒片對胃腸功能障礙大鼠胃腸道乙酰膽堿及P物質的影響*

李 瓊 劉同慎 劉孟安△

1 濱州醫學院中西醫結合學院（煙臺 264003）

2 濱州醫學院基礎學院（煙臺 264003）

胃腸舒片對胃腸功能障礙大鼠胃腸道乙酰膽堿及P物質的影響*

李 瓊1劉同慎2劉孟安1△

目的探討中藥胃腸舒片促進胃腸動力作用機理。方法將50只Wistar大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、胃腸舒小劑量組、胃腸舒大劑量組、西沙必利組。除正常對照組外，其余4組均制備胃腸動力障礙動物模型，分別用等容積的受試藥液灌胃，連續7d，將各組動物麻醉后選取胃腸標本。免疫組化法觀察神經遞質Ach及P物質的表達變化，采用圖像分析儀測定其肌間神經叢光密度值。結果中藥胃腸舒片能明顯增加胃腸組織中Ach及P物質分泌，與模型組比較有顯著差異。結論中藥胃腸舒促進胃腸動力的作用機制，可能是通過增加胃腸道Ach及P物質分泌，Ach及P物質與相應受體結合，增加胞內Ca2+濃度，Ca2+信號系統引發一系列生理功能，從而促進胃腸平滑肌的收縮效應。

中藥 胃腸舒片 神經遞質 乙酰膽堿 P物質

1 濱州醫學院中西醫結合學院（煙臺 264003）

2 濱州醫學院基礎學院（煙臺 264003）

*國家自然科學基金資助項目（No.30873263）

△通訊作者

中藥胃腸舒片是我們研制的促胃腸動力藥（批準文號：魯藥制字Z1620030009），對胃腸動力障礙性疾病療效滿意[1～3]。現就其作用機制探討如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠50只，雌雄各半，體重180～200g，購自煙臺綠葉實驗動物中心;西沙必利由山東達因海洋生物制藥股份有限公司生產;胃腸舒片由濱州醫學院附屬醫院制劑室提供;兔抗大鼠多克隆乙酰膽堿酯酶抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供;P物質兔抗大鼠多克隆抗體由北京博奧森生物工程有限公司提供;SP法免疫組化試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供;病理圖像分析系統為美國Media Cybernetics產品。

1.2 方法 （1）造模及標本處理：將50只大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、胃腸舒小劑量組、胃腸舒大劑量組、西沙必利組。除正常對照組外，其余4組參考食積動物模型方法[4]制備腸動力障礙實驗動物模型。造模成功后各組給予相應藥物：正常對照組不給任何藥物，模型組給予生理鹽水，胃腸舒小劑量組給胃腸舒溶液（含生藥75mg/mL），胃腸舒大劑量組給胃腸舒溶液（含生藥150mg/mL），西沙必利組給西沙必利混懸液 （含生藥0.51mg/mL），均20mL/kg，每日2次灌胃。實驗給藥第7日各組動物禁食24h（不禁水、藥），于次日以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，取胃竇、空腸（十二指腸與空腸交接下0.5cm處）標本，4%冷多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片，厚度5μm。（2）免疫組化法觀察神經遞質乙酰膽堿及P物質的表達變化：應用免疫組化SP法，取相鄰兩套切片在60℃溫箱烘24h以上，常規脫蠟至水，用0.3%過氧化氫甲醇封閉內源性過氧化物酶30min（室溫），微波修復抗原（抗原修復液為pH 6.0檸檬酸緩沖液）10min后室溫冷卻，經PBS液漂洗后，滴加封閉用正常山羊血清工作液，37℃孵育30min，兩套切片分別滴加兔抗大鼠乙酰膽堿酯酶多克隆抗體（效價1∶50）、兔抗大鼠P物質多克隆抗體（效價1∶75），4℃過夜，PBS漂洗5min，共3次，滴加生物素化山羊抗兔二抗工作液，37℃孵育30min，PBS漂洗后，滴加辣根過氧化氫酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS液漂洗后，DAB顯色，將切片置流水中終止呈色反應，蘇木素復染，以梯度濃度酒精脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片待檢。（3）圖像分析處理：用顯微圖像分析系統，將待測切片放置在連接計算機的顯微鏡下，分別對免疫組化染色切片中的陽性表達結果進行定量分析。觀察肌間神經叢中陽性神經元的染色及分布情況，每張切片上，每只大鼠胃及小腸組織于40倍物鏡下選取5個視野采集圖像。將圖像掃描至計算機，計算出每個視野陽性染色的光密度（OD）值。

1.3 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以（±s）表示,采用方差分析及組間兩兩比較。

2 結果

圖1 胃腸道乙酰膽堿神經元表達

各組胃腸道乙酰膽堿酯酶與P物質的表達變化、胃竇與小腸肌間神經叢的光密度值結果見表1、圖1、圖2。從表1可見，模型對照組胃竇與空腸組織中AchE及P物質均低于正常對照組（P＜0.01），說明復制的胃腸動力障礙性動物模型成功，并提示胃腸道興奮性神經遞質Ach及P物質分泌減少是胃腸動力障礙的主要原因。胃腸舒小、大劑量組及西沙必利組用藥后，胃竇和空腸組織中AchE及P物質均高于模型對照組 （P＜0.01），胃腸舒大劑量組胃竇組織AchE、胃竇和空腸組織中P物質增加的幅度大于西沙必利組（P＜0.01）。提示中藥胃腸舒促進胃腸動力的作用機制與增加胃腸道興奮性神經遞質Ach及P物質分泌有關。

表1 各組胃竇和小腸腸肌間神經叢光密度值比較（±s）

表1 各組胃竇和小腸腸肌間神經叢光密度值比較（±s）

與正常對照組比較，*P＜0.01;與模型對照組比較，△P＜0.01;與西沙比利組比較,▲P＜0.01

正常對照組模型對照組胃腸舒小劑量組胃腸舒大劑量組西沙必利組10 10 10 10 10胃竇0.1611±0.0039 0.1493±0.0076*0.1979±0.0083△0.1981±0.0049△▲0.1750±0.0129△空腸0.1524±0.0089 0.1371±0.0075*0.1899±0.0107△0.1931±0.0135△0.1885±0.0142△胃竇0.1064±0.0057 0.0961±0.0128*0.1099±0.0079△0.1333±0.0056△▲0.1176±0.0072△空腸0.1274±0.0071 0.1117±0.0103*0.1168±0.0077 0.1263±0.0092△▲0.1155±0.0072組 別 n AchE P物質

圖2 胃腸道P物質神經元表達

3 討論

胃腸動力障礙性疾病屬于中醫學“痞滿”范疇，以腹部痞滿不舒，或脹痛、納呆、早飽、食后飽脹、惡心、嘔吐、噯氣等為主要臨床表現。多由胃腸淤滯，氣機不暢，以致脾胃升降失司所致。治療重在瀉胃腸積滯，通胃腸腑氣，恢復脾胃升降協調。中藥胃腸舒片中大黃瀉胃腸積滯,通胃腸腑氣為君藥;枳實行氣消脹，破積除滿為臣藥;甘草健脾益氣，甘緩和中，調和諸藥，防大黃攻下傷正之弊為佐使。故諸藥相互配伍，以瀉胃腸積滯，調暢胃腸氣機，恢復脾胃升降協調而達到治療目的。現代醫學認為本病主要病理生理基礎為胃排空延遲及小腸傳輸功能障礙[5，6]。中藥胃腸舒能加快胃腸推進運動，其作用機理與其加大胃腸平滑肌自發活動的收縮幅度有關，而對收縮頻率無明顯影響[7]。故中藥胃腸舒片治療胃腸動力障礙性疾病，其組方既符合中醫辨證論治，也符合現代醫學觀點。

胃腸動力障礙性疾病的發生可能與中樞神經系統、自主神經系統、腸肌間神經叢、胃腸道平滑肌等有關，這些組織結構的功能聯系依賴于各種神經遞質和體液因子的釋放，各種遞質與相應的受體結合，執行不同的生理功能，成為胃腸動力藥發揮藥理作用的生理學基礎[8，9]。Ach作為膽堿能神經釋放的一種興奮性神經遞質，對胃腸平滑肌的收縮起著重要作用[10]，用于研究生理或病理狀態下胃腸運動變化[11，12]。目前公認AchE活性增強則代表Ach釋放增加，膽堿能神經興奮性增高。副交感神經節后纖維釋放Ach作用于平滑肌M受體后可開放質膜上L型Ca2+通道，使Ca2+內流使胃腸平滑肌收縮[13～16]。P物質作為一種重要的胃腸肽，對胃腸道的興奮作用表現為對胃腸縱行肌和環行肌的雙重收縮效應，包括直接的短時作用和緊隨的由膽堿能神經釋放Ach引起的長時作用[17]。P物質與其相應受體結合,激活磷酸脂酶C,使磷脂酰肌醇二磷酸水解,產生肌醇三磷酸而使胞內鈣濃度升高，Ca2+信號系統引發一系列生理功能，包括胃腸平滑肌的收縮效應[18]。實驗顯示SP可激活兩種不同的鈣內流通道[19]。本研究表明，模型對照組胃竇及空腸AchE及P物質較正常對照組顯著減少，提示復制胃腸動力障礙的動物模型成功。經用中藥胃腸舒片后，胃竇和空腸部AchE及P物質的分泌均較模型對照組顯著增加。結合既往研究證實中藥胃腸舒片能顯著增加胃腸平滑肌細胞游離Ca2+濃度[20]，筆者認為中藥胃腸舒片促胃腸動力的作用機制，可能是通過增加胃腸道Ach及P物質的分泌，Ach及P物質與相應受體結合，增加胞內Ca2+濃度，Ca2+信號系統引發一系列生理功能，而促進胃腸平滑肌收縮效應。

[1]劉孟安，姜學連，孫豐潤，等.胃腸舒治療痞滿證的臨床觀察[J].中國中醫急癥，2006，15（3）：843 ～844.

[2]劉孟安，趙銘山，孫豐潤，等.胃腸舒治療胃輕癱綜合征的臨床研究[J].濱州醫學院學報，2004，27（4）：269 ～270.

[3]姜秀清，呂耀鳳，劉孟安，等.胃腸舒對婦科手術后胃腸功能恢復的臨床及實驗研究 [J].中華現代臨床醫學雜志，2004，2（6）：872～873.

[4]李中南，許冠蓀，孫子平.健脾和胃飲對食積動物模型的實驗研究[J].陜西中醫，1996，17（7）：330～331.

[5]劉維新，洪興，傅寶玉，等.功能性消化不良患者消化間期血漿胃動素水平及胃十二指腸動力的改變 [J].世界華人消化雜志，2001，9（6）：722 ～ 724.

[6]曹曙光，吳萬春.應激與小腸運動的研究進展[J].世界華人消化雜志，2003,11（12）：2005～2007.

[7]劉孟安，張樹平，趙巖等.胃腸舒片的藥理與毒理實驗研究[J].時珍國醫國藥，2007，18（10）：1642 ～1643.

[8]Camilleri M,Bueno L,de Ponti F,et al.Pharmacological and pharmacokinetic aspects of functional gastrointestinal disorders[J].Gastroenterology，2006,130（5）:1421 ～1434.

[9]De Ponti F,Malagelada JR.Functional gut disorders：from motility to sensitivity disorders A review of current and investigational drugs for their management[J].Pharmacol Ther，1998,80（1）:49 ～ 88.

[10]Dinan TG,Scott LV,Brady D,et al.Altered hypothalamic cholinergic responses in patients with nonulcer dyspepsia:a study of pyridostigmine-stimulated growth hormone release[J].Am J Gastroenterol,2002，97（8）：1937 ～1940.

[11]何俊堂,劉海峰,房殿春，等.慢傳輸型便秘大鼠結腸肌間神經叢膽堿能神經及氮能神經的組化研究[J].解放軍醫學雜志，2004，29（10）：854 ～ 856.

[12]朱金照,冷恩仁,張捷.大腹皮對大鼠胃電節律紊亂的影響及機制[J]. 解放軍醫學雜志，2002，27（1）：39 ～40.

[13]Kovac JR,Chrones T,Sims SM.Temporal and spatial dynam icsunderlying capacitative calcium entry in human colonic smoothmuscle[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,75（2）:74～85.

[14]Kang D,Hur CG,Park JY,et al.Acetylcholine increases Ca2+influx by activation of CaMKII in mouse oocytes[J].B iochem Biophys Res Commun,2007,360（2）:476～482.

[15]Fagundes DS,Grasa L,A rruebo MP,et al.Ca2+-activated K+channels involved in duodenal dismotility induced by ethanol[J].A Lcohol,2007,42（4）:291～295.

[16]Chung W S,Farley JM.Tachyphylaxis to the inhibitory effect of L-type channel blockers on Ach-induced[Ca2+]ioscillations inporcine tracheal myocytes[J].J Biomed Sci,2007,14（1）:129～143.

[17]梅懋華.消化道生理學與臨床 [M].北京:人民衛生出版社,1990:221.

[18]Depoortere I,Pecters TL.Transduction mechanism of motilin and motilides in rabbit duodenal smooth muscle[J].Regul Pept,1995,55（3）:227～235.

[19]Mayer EA,Loo DDF,Snape WJJR,et al.The activation of calciumand calcium activated postassium channels in mammalian colonic smooth muscle by substance P[J].J Physiol,1990,420:47～71.

[20]宋曉冬，楊成，劉孟安，等.胃腸舒對大鼠胃腸平滑肌細胞鈣離子濃度的影響[J].濱州醫學院學報，2008，31（1）：1～4.

Influence of Weichangshu Tablet on Ach and Substance P in Gastrointestinal Tract of Rats with Gastrointestinal Dysfunction

LI Qiong1,LIU Tong-shen2,LIU Meng-an1△
1 Integrated Traditional and Western Medicine College of Binzhou Medical University（Yantai 264003）
2 Basic College of Binzhou Medical University（Yantai 264003）

Objective:To investigate the effect of Weichangshu Tablet on gastrointestinal motility.Methods:50 Wistar rats were divided into 5 groups randomly:normal group,model group,low dosage Weichangshu Tablet group,high dosage Weichangshu Tablet group and cisapride group.In addition to the normal group,the other 4 groups were prepared animal models of gastrointestinal motility disorder.The groups were given the same volume solution of corresponding medicine by gastric perfusion for 7d.The gastrointestinal samples were taken after rats were anesthetized.The expression change of Ach and substance P were determined by immunohistochemical method.The optical density of myenteric plexus were measured with mitrosperegraph.Results:Weichangshu Tablet could effectively increase Ach and substance P in gastrointestinal tract.Compared with model group,there was significant difference.Conclusion:The mechanism of Weichangshu Tablet promoting gastrointestinal motility may be that can increase Ach and substance P,which act on corresponding receptors and enhance the Ca2+concentration then the Ca2+signal system cause gastrointestinal smooth muscle contraction.

Traditional Chinese medicine;Weichangshu Tablet;Neurotransmitter;Acetylcholine;Substance P

R285.5

A

1004-745X（2010）01-0096-03

2009-07-28）