茶多酚和粉防己堿聯合抗腫瘤藥物對鼻咽癌耐藥細胞株HNE-1（200）增殖的抑制作用*

王洪鵬 葉 琳 王 馳 陳鴻雁△

1 重慶醫科大學附屬第一醫院（重慶 400016）

2 重慶醫科大學藥學院（重慶 400016）

茶多酚和粉防己堿聯合抗腫瘤藥物對鼻咽癌耐藥細胞株HNE-1（200）增殖的抑制作用*

王洪鵬1葉 琳1王 馳2陳鴻雁1△

目的研究天然有效成分茶多酚（TP）和粉防己堿（TET）分別聯合4種常見抗腫瘤藥物對鼻咽癌耐藥細胞株HNE-1（200）增殖的抑制作用。方法以鼻咽癌耐藥細胞株HNE-1（200）為研究對象，用MTT法測定無毒劑量的TP和TET分別聯合順鉑（DDP）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、長春新堿（VCR）、阿霉素（ADM）對實驗細胞的增殖抑制率。結果無毒劑量的TP分別與4種抗腫瘤藥物聯合應用后，藥物對HNE-1（200）細胞的抑制率增加約200%;無毒劑量的TET分別與4種抗腫瘤藥物聯合應用后，藥物對HNE-1（200）細胞的抑制率增加約300%。結論無毒濃度的天然藥物TP、TET分別與抗腫瘤藥物聯合應用能提高藥物對鼻咽癌耐藥細胞株的增殖抑制率，降低藥物的IC50。

茶多酚 粉防己堿 鼻咽癌 HNE-1（200）細胞系 多藥耐藥

1 重慶醫科大學附屬第一醫院（重慶 400016）

2 重慶醫科大學藥學院（重慶 400016）

*重慶市衛生局資助課題（No.2006-B-16）

△通訊作者

鼻咽癌我國南方常見的頭頸部惡性腫瘤之一，化療是臨床治療鼻咽癌晚期的主要方法之一，而多重耐藥（MDR）的產生導致鼻咽癌細胞對化療藥物敏感性下降，嚴重影響了化療的效果。大部分化療藥物和化療增敏劑具有較大的毒副作用，未能廣泛應用[1，2]。近年來，從天然藥物中篩選出高效、低毒性的化療增敏劑已成為研究熱點。本研究選用天然有效成分茶多酚（TP）和粉防己堿（TET）檢測其分別和4種常見抗腫瘤藥物聯合應用對鼻咽癌耐藥細胞株的增殖抑制作用，為天然藥物在頭頸腫瘤化療中的應用提供依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞系和培養條件：鼻咽癌耐藥細胞株HNE-1（200）細胞株由重慶醫科大學藥學院王馳副教授提供，由人鼻咽癌細胞HNE-1經放射線誘導而來。細胞培養條件：含10%新生牛血清的RPMI-1640培養基中，37℃ 5%CO2飽和濕度條件下常規培養。（2）試劑：RPMI-1640培養基（GIBlo，美國）;新生牛血清（購自杭州四季青生物工程材料研究所）;粉防己堿（重慶醫科大學藥學院王馳副教授惠贈）;四甲基偶氮唑鹽（MTT，購自北方同正生物制品公司）;DDP、5-Fu、VCR、ADM均為國產;TP為黃褐色粉末（含量60%，Sigma公司產品）。（3）儀器和設備：二氧化碳孵箱（美國LRBODEL）;超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）;XSZ-D2倒置顯微鏡 （重慶光學儀器廠）;Model 450型酶標儀（美國BIO-RAD酶標儀）;Varian 600C型直線加速器 （美國）;光學顯微鏡（Olympus）。

1.2 方法 （1）MTT法測定抗腫瘤藥物抑制HNE-1（200）耐藥細胞株生長：取對數生長期HNE-1（200）耐藥細胞稀釋至（1.5～2）×105/mL，于96孔細胞培養板中培養1d，加藥，繼續培養4d，棄去培養液，每孔加0.5mg/mL的MTT 20μL培養液，培養4h，棄去培養液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，待溶解后用BIO-RAD Model 450型酶標儀于570nm處測吸光度值A570，并計算腫瘤細胞存活率，從而預測抗腫瘤藥物對某種腫瘤細胞的抑制作用。腫瘤細胞抑制率（fa%）=[1-實驗孔A570/對照孔A570]×100% 。（2）MTT法測定單獨應用DDP、5-Fu、VCR、ADM對HNE-1（200）耐藥細胞株的增殖抑制作用：處理組中加入不同濃度的DDP、5-Fu、VCR及ADM，對照組除不含抗腫瘤藥物外其他條件完全一致。分組方法及濃度如下：DDP處理組設置A（0.25μg/mL）、B（0.5μg/mL）、C（1.0μg/mL）、D（1.5μg/mL）、E（3.0μg/mL）5個質量濃度水平。5-FU處理組設置 A（3.125μg/mL）、B（6.25μg/mL）、C（12.5μg/mL）、D（25.0μg/mL）、E（50.0μg/mL）5個質量濃度水平。ADM處理組設置A（1.25μg/mL）、B（2.5μg/mL）、C（5.0μg/mL）、D（10.0μg/mL）、E（20.0μg/mL）5個質量濃度水平。VCR處理組設置A（2.5μg/mL）、B（5.0μg/mL）、C（10.0μg/mL）、D（20.0μg/mL）、E（40.0μg/mL）5個質量濃度水平。（3）MTT法測定無毒劑量的TP、TET分別與4種化療藥物聯合應用對HNE-1（200）耐藥細胞株的抑制作用：TP、TET對實驗細胞株無毒濃度篩選（方法參見文獻[3]）。MTT法測定無毒劑量的TP、TET分別與4種化療藥物聯合應用對HNE-1（200）耐藥細胞株的抑制作用：實驗組和對照組分別加入對細胞無直接損害作用的TP、TET濃度，與不同質量濃度的抗腫瘤藥物聯合使用（抗腫瘤藥物的質量濃度不變），測定其HNE-1（200）耐藥細胞株的增殖抑制率（方法參見參考文獻[3]）根據線性方程計算其半數抑制濃度（IC50）值。1.3 統計學處理 應用SPSS 10.0統計軟件。采用單因素方差分析，回歸方程的建立采用直線回歸法。

2 結果

2.1 單獨應用DDP、5-Fu、VCR、ADM對HNE-1（200）耐藥細胞株的增殖抑制作用 見表1。單獨應用DDP、5-Fu、VCR、ADM對HNE-1（200）耐藥細胞株的增殖抑制作用呈較明顯劑量依賴關系（P＜0.05），細胞抑制率為6% ～65%。

表1 不同抗腫瘤藥物對HNE-1（200）耐藥細胞株的抑制作用 （%）

2.2 TP、TET對實驗細胞株的無毒劑量篩選 見圖1。經過MTT法測定，回歸分析得出TP、TET對細胞抑制率小于10%時的藥物質量濃度分別為0.15mg/mL、1.5μg/mL。以此質量濃度藥物分別與HNE-1（200）細胞共同孵育，測定細胞的生長曲線，結果顯示，加藥組的生長曲線與對照組的生長曲線相近似（P＞0.05）。表明在此質量濃度下，TP、TET對細胞無毒性。

圖1 TP、TET無毒劑量篩選結果

2.3 MTT法測定無毒濃度的TP、TET分別與4種化療藥物聯合應用對HNE-1（200）耐藥細胞株的抑制作用 見圖2～圖5、表2。TP分別與DDP、5-Fu、VCR、ADM聯合應用對HNE-1（200）細胞的抑制率提高到19.01% ～79.66%，抑制率是單用抗腫瘤藥物的120% ～300%;TET分別與DDP、5-Fu、VCR、ADM聯合應用對HNE-1（200）細胞的抑制率提高至29.95%～81.96%，為單用抗腫瘤的126% ～400%。并且抗腫瘤藥物濃度越小，兩種天然成分的增效作用越強（P＜0.05），為進一步了解各組增殖抑制率，采用直線回歸計算各組IC50值。從表2中可見聯合用藥組IC50均小于單用化療藥物（P＜0.05）。

圖2 幾種藥物與順鉑相互作用對HNE-1（200）細胞抑制作用的影響

圖3 幾種藥物與5-Fu相互作用對HNE-1（200）細胞抑制作用的影響

圖4 幾種藥物與長春新堿相互作用對HNE-1（200）細胞抑制作用的影響

圖5 幾種藥物與阿霉素相互作用對HNE-1（200）細胞抑制作用的影響

3 討論

MDR是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產生抗藥性的同時，對其它結構和作用機理不同的抗腫瘤藥物也產生交叉抗藥性，其發病機制復雜，如何逆轉MDR，提高藥物對腫瘤細胞的增殖抑制率，是目前研究的一大難點。研究表明，聯合用藥是臨床治療惡性腫瘤的常用方法之一，化療藥物與化療藥物聯合作用效果好，但由于毒副作用較大限制了其廣泛應用[3，4]。天然藥物具有不良反應少、毒性低的特點，在我國及其它亞洲國家廣泛應用[5]，成為目前研究的熱點。

表2 各實驗組抑制HNE-1（200）細胞的IC50變化

TP是組成復雜的茶葉提取物，具有化療增敏作用，冉鐵成等[6]通過細胞實驗，觀察TP的劑量-效應關系，從而確證了茶多酚確有化療增敏作用。但目前對TP的研究在頭頸腫瘤較少見。

TET是是防己科植物粉防己的主要活性成分。資料表明粉防己堿具有多種生物學效應，在腫瘤防治等方面具有很好的應用前景。研究表明，粉防己堿能明顯增強柔紅霉素和長春新堿殺傷白血病細胞的能力，1.0×10-6mol/L的TET增加化療藥物DNR、VCR殺白血病細胞的作用為30%左右，并隨著藥物濃度的升高，促殺傷效應逐漸增強[7，8]。但是粉防己堿對鼻咽癌耐藥細胞株作用報道較少。

本實驗以采用MTT法檢測了不同質量濃度的4種抗腫瘤藥物DDP、5-Fu、VCR、ADM單用和分別聯合無毒劑量的TP、TET對鼻咽癌耐藥細胞HNE-1（200）的增殖抑制作用，試圖發現單獨用藥和聯合兩種天然化療增敏劑對鼻咽癌耐藥細胞株的作用特點。結果顯示，單用化療藥物，細胞抑制率在6%～65%之間，抑制作用呈劑量依賴關系;化療藥物聯合應用無毒劑量的TP后，細胞抑制率提高到11% ～79%，約為單獨用藥的122%，聯合用藥IC50下降至單獨用藥的1/2左右;化療藥物聯合應用無毒劑量的TET后，細胞抑制率提高到20%～85%,為單獨用藥的約131%，聯合用藥IC50下降至單獨用藥的1/2～1/3左右。單抗腫瘤藥物質量濃度越小時，聯合兩種天然有效成分的化療增敏作用越明顯，提示較小劑量的抗腫瘤藥物聯合天然成分具有較明顯的減毒增效作用。

綜上所述，本實驗初步顯示天然有效成分TP和TET在體外對鼻咽癌耐藥細胞具有較好的化療增敏作用，提示臨床鼻咽癌晚期化療可采用抗腫瘤藥物聯合應用一種或多種天然有效成分以提高治療效果，這對提高晚期鼻咽癌患者5年生存率及其生活質量都具有一定的意義，同時也為TP和TET作為化療增敏劑的進一步研究和應用，提供了試驗室依據。

[1]Fu LW，Deng ZA，Pan QC.et al.Screening and discovery of novel MDR modifiers from anturally occurring bisbenzylisoquinoline alkaloids[J].Anticancer Res，2001，21（4A）：2273 ～ 2280.

[2]Choi SU，Park SH，Kim KH，et al.The bisbenzylisoquinolineal alkaloids tetrandine and fan gchinoline，ehance the cytotoxicity of multidrug resistance related drugs,Aamodulation of P-glycoprotein[J].Anticancer Drugs，1998，9（3）：255.

[3]Gottesman MM，Pastan L，Ambudkar SV.P-glycoprotein and multidrug resistance[J].Curr Opin Genet Dev，1996，6（5）：6 ～10.

[4]Donna M，Bradshaw，Robert J，et al.Clinical relevance of transmembrane drug as a mechanism of multidrug resistance [J].Journal of Clinical Oncology，1998,16（11）：3674.

[5]王天曉，張鳳春，楊曉虹.敏藥堿-G逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的作用和機制研究[J].中國藥理報,2005，21（5）：184～186.

[6]冉鐵城，王毅，劉新起，等.茶多酚主要成分對腫瘤多藥耐藥性的逆轉作用[J].核化學與放射化學，2003，25（2）：74～80.

[7]許文林，敖忠芳，陳玉心，等.漢防己甲素對柔紅霉素和長春新堿增效作用的實驗研究 [J].中華血液學雜志，1994，15（5）：256～257.

[8]許文林，敖忠芳，陳寶安，等.漢防己甲素逆轉血液系統腫瘤細胞多藥耐藥的臨床研究[J].中華內科雜志，2001，40（9）：631～633.

Study of the Inhibitive Effects of Tea Polyphenols and Tetrandrine Combined with Antineoplastic Drugs on the HNE-1（200）Cell Line

WANG Hong-peng1,YE Lin1,WANG Chi2,et al
1 The First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University（Chongqing 400016）
2 Chongqing Medical University（Chongqing 400016）

Objective:To obverse the inhibitive effects of tea polyphenols and tetrandrine apiece combined with 4 kinds of antineoplastic drugs on the HNE-1 （200）cell line.Methods:MTT method was used to determine the inhibitory proliferation effects of non-toxic dose tea polyphenols and tetrandrine apiece combined with DDP,5-Fu,VCR and ADM on HNE-1（200）cell line.Results:Non-toxic dose tea polyphenols combined with 4 kinds of antineoplastic drugs could increase the inhibitory rate to 200%.Non-toxic dose tetrandrine could increase it to 300%.Conclusion:Non-toxic dose tea polyphenols and tetrandrine apiece combined with antineoplastic drugs can increase the inhibitory rate of it on HNE-1（200）cell line and decline IC50of antineoplastic drugs.

Tea polyphenols;Tetrandrine;Nasopharyngeal carcinoma;HNE-1（200）cell line;Multidrug resistance

R285.5

A

1004-745X（2010）01-0102-03

2009-08-09）