HPLC 法測定漢中參葉中人參皂苷Rd 的含量

宋小妹 馮改利 李淵源 葛 莉 王 薇

陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046

漢中參葉，即珠子參葉。為五加科人參屬植物珠子參Panax japonicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥地上莖葉。為陜西秦巴山區民間習用藥材，具有清熱生津、潤喉利咽、安神的功效。主要用于肺熱口渴、喉干舌燥、暑熱生津、頭暈目眩、心煥神散疲等的治療。民間多以單葉入茶飲用,歌舞藝人常用來保護嗓音,保持體力，解暑。現化學研究表明，漢中參葉富含多種人參皂苷類成分，如人參皂苷Rd、Re、Rg1、Rg2和F2，珠子參苷F1，F2，F3，F4，F5，F6[1-3]，此外，尚含多種氨基酸及微量元素[4]；藥理研究表明，漢中參葉總皂苷可對抗二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，減少醋酸致小鼠毛細血管通透性增加，抑制肉芽組織增生；對熱板引起的疼痛有一定的鎮痛效果；能延長缺氧條件下小鼠存活時間[5-6]。為此，本實驗采用HPLC 法建立漢中參葉中人參皂苷Rd 的含量，為客觀準確評價漢中參葉藥材質量，合理開發利用漢中參葉藥材資源提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-2010AHT 高效液相色譜儀；Shimadzu LCsolution 工作站；SB-3200D 型超聲清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，180w，40kHz）；BP-121S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

1.2 樣品與試劑 漢中參葉采自陜西寧強，經陜西中醫學院藥學院中藥標本館高級實驗師王繼濤老師鑒定為珠子參Panax japonicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng 的干燥地上莖葉。人參皂苷Rd 對照品（中國固體制劑制造技術國家工程研究中心提供）；乙腈為色譜純（SK Chemicals 公司），水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Iner tsi l ODS-sp（5μm，4.6mm×150mm）；流動相：乙腈：水(32∶64)，檢測波長：203nm，流速：1.0ml/min；進樣量：10μl；柱溫：30℃；理論板數按人參皂苷Rd 峰計算應不低于3000。

人參皂苷Rd 對照品和供試品HPLC 圖譜見圖1、圖2。

圖1 人參皂苷Rd 對照品HPLC 色譜圖

圖2 漢中參葉供試品HPLC 色譜圖

2.2 對照品溶液配制 精密稱取人參皂苷Rd 對照品4.5mg，置于10ml 量瓶中，加甲醇溶解、定容，搖勻，待用。

2.3 供試品溶液的配制 取參葉粉末2g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇50ml 超聲處理30min，過濾，濾液蒸干，加水分散，石油醚反復萃取，每次20ml，棄去石油醚層，再用水飽和正丁醇萃取3次（分別為20、15、15ml），合并正丁醇層，水浴蒸干，殘渣用少量甲醇溶解、并轉移定容至5ml量瓶中，備用。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取人參皂苷Rd 對照品溶液2、5、10、15、20ul 注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以人參皂苷Rd 進樣量（ug）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=126191X-39983，r=0.9998。結果表明，人參皂苷Rd 在9～90ug 范圍內線性關系良好。

2.5 精密度考察 取同一供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件，重復進樣5次，每次10ul，測得人參皂苷Rd 峰面積的RSD 為1.7%，表明本方法精密度良好。

2.6 穩定性考察 取供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24h 進樣，每次10ul，記錄峰面積，計算人參皂苷Rd 的RSD 為1.8%，表明供試品溶液在24h 穩定。

2.7 重復性考察 取同一批樣品5份，按2.3項下方法制備供試品溶液，每份進樣10ul，測得人參皂苷Rd 含量的RSD 為0.4%，表明本方法重復性良好。

表1 加樣回收率試驗結果(n=3)

2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的漢中參葉粉末約0.1g，共5份，精密稱定，分別準確加入人參皂苷Rd 對照品，按2.3項下方法制備供試品溶液，每份進樣10ul 測定人參皂苷Rd 的峰面積，計算平均回收率99.77%，RSD=1.67%（見表1）。

2.9 樣品測定 精密稱取漢中參葉粉末2.0g，按照供試品溶液制備方法制備樣品溶液，進樣10ul，測定峰面積，計算含量，結果表明，漢中參葉中人參皂苷Rd 含量為0.51%（n=3）。

3 結果與討論

3.1 通過實驗研究，建立了漢中參葉中人參皂苷Rd 的含量測定方法，實驗過程分別對甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-水等的不同配比流動相進行了的考察，結果采用乙腈-水(32∶64)，峰與相鄰峰均能達到基線分離，且峰形較好，空白溶劑無干擾。

3.2 實驗對提取方法、提取溶媒、提取時間等進行了考察研究，結果表明，用甲醇溶液50ml，超聲處理30min，即能提取完全。

3.3 由于樣品為地上部分，葉綠素含量很高，因此供試品溶液的純化制備就成為本項的關鍵之一。實驗過程采用了反復石油醚萃取除去葉綠素，但還不盡理想，時有柱壓過高的現象發生，因此，應進一步加強供試品溶液純化制備方法的研究，以保證測試結果的準確穩定。

[1]楊崇仁，伍明珠，周俊，等．珠子參葉的三萜皂苷成分[J]．云南植物研究，1984，6(1)：118-120.

[2]馮寶樹，汪夕彬，王答祺，等．秦嶺產珠子參葉的達瑪烷型皂甙研究[J]．云南植物研究，1987，9(4)：477-484.

[3]王答祺，馮寶樹，汪夕彬，等．秦嶺產珠子參葉的達瑪烷型皂甙的進一步研究[J]．藥學學報，1989，24(8)：633-636.

[4]李映麗，呂居嫻，馮變玲，等．參葉-大葉三七葉中氨基酸及微量元素分析[J]．西北藥學雜志，1996，4(11)：11.

[5]姜祎，考玉萍，宋小妹．珠子參葉總皂苷抗炎鎮痛作用的實驗研究[J]．陜西中醫，2008，29(6)：732，733．

[6]考玉萍，姜祎，宋小妹．珠子參葉總皂苷抗抗疲勞抗應激作用的實驗研究[J]．陜西中醫，2008，29(8)：1092，1093.