不同齲敏感兒童變異鏈球菌臨床分離株合成胞外多糖能力的實驗研究

楊江華，曹元書，劉興容

(瀘州醫學院附屬口腔醫院，四川 瀘州 646000)

變異鏈球菌是乳牙齲患兒口腔中的主要致齲菌，合成胞外多糖的能力是其致齲的重要條件之一。變異鏈球菌的葡糖基轉移酶（Glucosyl transferases，GTF）可利用蔗糖合成細胞外多糖，包括水溶性葡聚糖和水不溶性葡聚糖。細胞外多糖對細菌在載體表面的附著以及細菌之間的集聚、維持生物膜的結構、提供營養等方面均起著十分重要的作用[1]。因此，研究細菌合成胞外多糖的能力對于細菌的致齲性研究有著重要意義。本實驗擬采用蒽酮法[2]比較不同齲敏感兒童變異鏈球菌臨床分離株合成水溶性及水不溶性葡聚糖的能力，為進一步研究兒童齲病的發病特點和預防措施奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 主要的儀器和設備 厭氧培養箱YQX型(上海躍進醫療器械廠)；紫外可見分光光度計UV-1100型（北京瑞利分析儀器公司）；定時磁力攪拌器JB-90-1型(上海天平儀器廠)；低頻離心機TDL-40B型（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 實驗菌株及細菌培養 變異鏈球菌國際標準菌株（S.mutans）ATCC 25175（血清型C）由四川大學華西口腔醫學院教育部口腔生物醫學工程重點實驗室提供。變異鏈球菌臨床分離株前期實驗分離得到的不同齲敏感兒童口腔變異鏈球菌111株，其中高齲組44株，中齲組36株，無齲組31株[高齲者：齲失補指數(dmft)≥6，中齲者：6＞dmft≥4，無齲者：dmft＝0]。變異鏈球菌臨床分離株和國際標準株常規復蘇，經鑒定為純培養后，挑取單個菌落轉種于腦心浸液肉湯(BHI)液體培養基，厭氧（80%N2、10%H2、10%CO2）培養24 h，鏡檢無污染后，3000 r/min，離心15 min，棄上清，收集細菌，無菌生理鹽水洗菌兩次，用無菌生理鹽水調整為于紫外分光光度計540 nm處吸光度A=1.0的菌懸液，備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備 取各變異鏈球菌臨床分離株菌懸液，按菌液與含1%蔗糖的BHI液體培養基1:10（v/v）比例接種細菌，37℃厭氧培養24 h后，3000 r/min，離心20 min，收集上清液，細菌沉淀物用5 ml蒸餾水洗滌、離心兩次，三次上清液合并；水洗后的細菌加入0.5 mol/L NaOH 5 ml洗滌、離心三次，合并上清液。兩部分上清液各取適量，分別加入三倍體積無水乙醇，4℃冰箱放置過夜，離心，棄水相，沉淀分別加入5 ml蒸餾水及5 ml 0.1 mol/L NaOH溶液溶解，備用。

1.3.2 蒽酮試劑和葡聚糖標準儲存液的制備 蒽酮試劑的配制：取200 mg蒽酮（Anthrone，上海生工生物有限公司）溶解于100 ml的濃硫酸中，攪拌溶解，放入4℃冰箱保存。葡聚糖標準儲存液的配制：稱取1.0 g分子量為9000 Da的葡聚糖（北京天佑達生物工程有限公司）溶于100 ml蒸溜水中做儲存液，使用時取1.0 ml稀釋至100 ml，保存于4℃冰箱中。

1.3.3 標準曲線的繪制 分別取葡聚糖稀釋液0.00 ml、0.05 ml、0.10 ml、0.20 ml、0.30 ml、0.40 ml、0.60 ml、0.80 ml，加入蒸餾水至1.00 ml，在 15℃水浴中加入蒽酮試劑3.00 ml，攪拌3 min后放入95℃水浴中煮6 min，冷卻，分別在分光光度計625 nm處比色，繪制標準曲線。

1.3.4 樣品的測定 取樣品1.0 ml，加蒽酮試劑3 ml，95℃水浴6 min，冷卻，紫外光分光光度計測定625 nm處的吸光度。

1.4 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件中的one-way ANVOA分別對不同細菌合成水溶性葡聚糖和水不溶性葡聚糖能力進行統計分析(α=0.05)。

2 結果

2.1 標準曲線回歸方程的估計 用葡聚糖標準品溶液和蒽酮法測標準曲線進行葡聚糖濃度標準曲線回歸方程估計。回歸公式：y(葡聚糖量)＝A+Bx，系數A＝-0.00136，回歸系數B＝0.07306，判定相關系數 R2＝0.999。y＝0.07306x－0.00136，P＜0.05，差異有統計學意義。

2.2 合成胞外多糖的測定 不同齲敏感兒童變異鏈球菌菌株合成胞外多糖的結果如表1。

表1數據顯示，不同菌株之間無論是合成水溶性葡聚糖還是水不溶性葡聚糖能力差異均有統計學意義（P＜0.05）。組間進行兩兩比較，發現高、中齲組細菌合成細胞外多糖的量和標準株合成細胞外多糖的量無明顯不同，但是與無齲組之間的差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 不同齲敏感兒童變異鏈球菌合成胞外多糖的比較(±s，mg/L)

表1 不同齲敏感兒童變異鏈球菌合成胞外多糖的比較(±s，mg/L)

注：*F=4.504，P＜0.05，**F=6.958，P＜0.05。

組別水不溶性葡聚糖*水溶性葡聚糖*高齲組中齲組無齲組標準株0.029±0.0150.024±0.0120.016±0.0110.032±0.0020.102±0.0430.095±0.0470.065±0.0440.132±0.001

在高齲組發現有部分菌株無論是合成水溶性葡聚糖還是水不溶性葡聚糖的量均高于其他菌株，如16-1、20-3、18-2、11-1號菌株。來自中齲組的15-2、1-1號菌株合成胞外多糖的能力也高于其他菌株；有部分菌株合成水溶性葡聚糖的量明顯高于其他菌株，如高齲組和中齲組中間的2-3、16-3、20-1、12-1號菌株。但是來自無齲組的菌株6-3號合成水溶性葡聚糖的量也很高。實驗還發現無論是高、中齲組變異鏈球菌還是無齲組變異鏈球菌合成水溶性葡聚糖的量均多于水不溶性葡聚糖的量。

3 討論

變異鏈球菌是牙菌斑生物膜中的優勢菌，與齲病的發生有密切關系[3]。它能利用蔗糖合成胞外多糖，促使牙菌斑生物膜的形成和穩定的維持。因此細胞外多糖的產量是變異鏈球菌致齲能力的一個衡量指標。

本研究發現高齲和中齲組兒童變異鏈球菌臨床分離株在體外合成的水溶性和水不溶性葡聚糖量均顯著高于無齲組變異鏈球菌。而且研究還發現有部分菌株合成的水溶性和水不溶性葡聚糖量都明顯高于其他菌株，這些菌株大多來自高齲組，中齲組也有少量的幾株，這提示有變異鏈球菌高致齲毒力株存在的可能，而且高毒力株主要存在于高齲組中，這與前期產酸耐酸實驗結果一致[4]；同時，還發現有一株來自無齲組，可能是無齲組菌株發生了基因突變。國內黃曉晶等[5]對恒牙齲的研究顯示高齲組個體定植的合成水不溶性及水溶性葡聚糖能力強的菌株所占比例顯著高于無齲組，本實驗結果與其一致。Alaluusua等[6]的研究發現齲活躍幼兒與無齲幼兒口腔中不同基因型變異鏈球菌合成細胞外多糖的能力不同，但細胞外多糖合成能力不同的菌株在兩組的分布差異沒有統計學意義。Mattos-Graner等[7]的研究結果則顯示變異鏈球菌水不溶性葡聚糖合成與乳牙齲發病率呈正相關。

本實驗還發現無論是高、中齲組變異鏈球菌還是無齲組變異鏈球菌合成的水溶性葡聚糖均多于水不溶性葡聚糖，這與國內學者研究結果一致。程茜等[8]通過酚硫酸法研究變異鏈球菌胞外多糖合成的能力，結果表明變異鏈球菌水溶性葡聚糖合成能力強于水不溶性葡聚糖。劉琪等[9]用Seff蒽酮定糖法對變異鏈球菌Ⅰ型Mutans和Ⅲ型Sobrious合成葡聚糖進行研究，結果發現變異鏈球菌Ⅰ型Mutans合成水溶性葡聚糖的能力高于水不溶性葡聚糖。

迄今已證實變異鏈球菌具有3種葡萄糖耐量因子(GTF)，分別合成水溶性及水不溶性葡聚糖。并且，不同血清型變異鏈球菌產生的GTF在結構、性質上都存在差異。各種血清型中，C型合成的水溶性葡聚糖較多，D型合成的水不溶性葡聚糖較多[10]。變異鏈球菌還可以按遺傳性分為Ⅰ-Ⅵ型，而在人類口腔中血清型C的遺傳Ⅰ型變異鏈球菌最多，檢出率高達80%[11]。這可能是導致本實驗不同齲敏感兒童口腔變鏈菌臨床分離株合成水溶性葡聚糖含量多于水不溶性葡聚糖的原因。

有研究表明，GTF及其合成的水不溶性葡聚糖在變鏈粘附中起重要作用。而Ⅰ型變異鏈球菌的粘附主要由變異鏈球菌表面的粘附素和唾液的受體介導完成，不依賴GTF及其合成的水不溶性葡聚糖。由此可以推測，在變異鏈球菌在牙面的粘附作用中，可能主要依賴唾液的介導，較少依賴于葡聚糖。對于不同基因型致齲能力不同的原因，變異鏈球菌致齲高毒力株在齲病發生過程中的具體作用機制以及合成水溶性和水不溶性葡聚糖的差異是否對變異鏈球菌的粘附產生影響，有待進一步的研究。

[1]徐蓉蓉,葛劍平,胡 濤,等.不同生存狀態下變異鏈球菌合成胞外多糖的研究[J].臨床口腔醫學雜志,2005,21(2):79-81.

[2]周學東.口腔生物化學[M].成都:四川大學出版社,2002:254-255.

[3]周學東,肖曉蓉.口腔微生物學[M].成都:四川大學出版社,2002:202-224.

[4]曹元書,劉興容.不同齲敏感兒童變異鏈球菌臨床分離株產酸、耐酸能力的實驗研究[J].口腔醫學雜志,2009,25(1):103-106.

[5]黃曉晶,劉天佳,楊錦波,等.高齲及無齲者變異鏈球菌臨床分離株致齲性研究Ⅱ合成細胞外多糖能力的實驗研究[J].華西口腔醫學雜志,2000,18(6):419-421.

[6]Van Ruyven FOJ,Lingstrom P,Van Houte J,et a1.Relationship among mutans streptococci,“low-pH”bacteria,and lodophilic polysaccharide producing bacteria in dental plaque and early enamel caries in humans[J].J Dent Res,2000,79(2):778-784.

[7]Mattos-Graner RO,Smith DJ,King WF,et a1.Water-insoluble glucan synthesis by mutans streptococcal strains correlates with caries incidence in l2-to 30-month-old children[J].J Dent Res.2000,79(6):l37l-l377.

[8]程 茜,劉艷玲.變異鏈球菌和遠緣鏈球菌的可溶性多糖和不溶性多糖的測定[J].口腔醫學,2000,20(3):124-125.

[9]劉 琪,羅宗蓮,周學東.變異鏈球菌I型和Ⅲ型合成葡聚糖的研究[J].廣東牙病防治,2000,8（1）:10-12.

[10]Tsumori H,Kuramitsu H.The role of the Streptococcus mutans glucosyltransferases in the sucrose-dependent attachment to smooth surfaces:essential role of the GtfC enzyme[J].Oral Microbiol Immunol,1997,12(5):274-277.

[11]Kozai K,Nakayama R,Tedjosasongko U,et al.Intrafamilial distrib-ution of mutans Streptococci in Japanese families and possibility of father-to-child transmission[J],Microbiol Immunol,1999,43(2):99-106.