超微超順磁性氧化鐵納米粒的制備及性能研究

劉國華，陳燕明，蔡 慶，陳曉軍，洪若瑜

（1.南京醫科大學附屬蘇州市立醫院東區呼吸科，江蘇蘇州 215001；2.南京醫科大學附屬蘇州市立醫院東區放射科，江蘇蘇州 215001；3.蘇州大學化學化工學院，江蘇蘇州 215123）

超微超順磁性氧化鐵納米粒的制備及性能研究

劉國華1，陳燕明1，蔡 慶2，陳曉軍1，洪若瑜3

（1.南京醫科大學附屬蘇州市立醫院東區呼吸科，江蘇蘇州 215001；2.南京醫科大學附屬蘇州市立醫院東區放射科，江蘇蘇州 215001；3.蘇州大學化學化工學院，江蘇蘇州 215123）

目的：制備超微超順磁性氧化鐵納米粒，并研究其物理、磁學性質及傳遞特性，探討其作為磁共振陰性對比劑的可能性。方法：共沉淀一步法制備葡聚糖包被的四氧化三鐵納米粒，采用X射線粉末衍射法(XRD)分析其內部晶體結構，傅立葉紅外光譜儀(FT－IR)分析其表面結構，透射電鏡(TEM)及動態激光粒度儀測量其大小，振動樣品磁強計(VSM)檢測磁化率等參數。此外，采用原子吸收光譜儀檢測家兔血和不同臟器中的樣品鐵含量，MRI觀察注射樣品后肝、淋巴結的增強效果。結果：所得樣品核心為四氧化三鐵晶體，表面包覆葡聚糖，核心粒徑6～8 nm，整體顆粒直徑為33 nm，樣品鐵含量為0.2 mmol/L。磁化曲線表現為超順磁性，飽和磁化強度為48.1 emu/g。樣品在家兔體內血循環時間較長(＞6 h),主要分布至脾、肝、肺、心、淋巴等網狀內皮系統，注射樣品后肝、淋巴結在T2WI信號明顯降低。結論：實驗表明，制備的樣品可作為一種新型的磁共振陰性造影劑，廣泛用于肝脾、淋巴結等多種疾病的診斷和治療。

超微超順磁性氧化鐵納米粒；物理性質；磁學性質；傳遞特性；磁共振陰性對比劑

隨著科技的進一步發展，納米生物材料被廣泛研究并投入臨床，其中超微超順磁性氧化鐵納米粒（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）作為一種新型的磁性納米生物材料，常用于磁共振的陰性對比劑、示蹤劑及靶向藥物載體等，但該產品價格昂貴，國內市場難覓蹤影，本實驗采用化學共沉淀一步法制備USPIO，從物理、磁學性質、傳遞特性等方面進行研究，探討其作為磁共振陰性對比劑應用于臨床的可能性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H－600－Ⅱ型透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）（日本日立公司），D/max－ⅢC型X射線粉末衍射儀（X-ray，diffraction，XRD）（日本理學公司），220FS/ZS 型原子吸收光譜儀（美國varian spectra公司），Avatar 360型傅立葉紅外光譜儀（Fouriertransform infrared，FT-IR）（美國 Nicolet公司），HPPS 5001型動態激光粒度儀（英國Malvern公司），BHV-55型振動樣品磁強計（vibrating sample magnetometer，VSM），德國Philips 1.5T超導MR系統。

1.2 試藥

三氯化鐵、氨水、葡聚糖T20、水合肼均為分析純，國藥集團化學試劑公司生產；硝酸（分析純）為江蘇金城試劑公司產品；高氯酸（分析純）為桃油化工廠產品。

2 方法與結果

2.1 共沉淀一步法制備樣品

共沉淀一步法制備外包葡聚糖的四氧化三鐵納米粒（USPIO）見圖 1，具體步驟：將三氯化鐵和氯化亞鐵（Fe3+∶Fe2+摩爾比1.75∶1）和2.5 g葡聚糖T20混合，加入0.5 ml水合肼，溶解在30 ml去離子水中，恒溫磁力攪拌器攪拌，滴加26.5%氨水10 ml，攪拌15 min，緩慢滴加氨水調節pH至10，升溫至60℃繼續反應3 h，冷卻后7 000 r/min離心20 min以除去大顆粒，取出上層磁流體，用截留分子量為50 000的透析膜透析24 h以除去磁流體中的剩余物。超聲振蕩5 min，將磁流體60℃真空干燥，分裝后滅菌，置于4℃冰箱，備用。

圖1 共沉淀一步法制備的樣品

2.2 樣品的性能研究

2.2.1 物理性質研究

2.2.1.1 TEM觀察粒子的形態和直徑 取適量磁流體樣品滴加于已制膜的銅網上，濾紙吸除多余的液體，干燥置于TEM觀察孔下觀察粒子的形態和直徑。

2.2.1.2 XRD分析粒子的晶體結構 取適量真空干燥的樣品顆粒研細成粉末，置于XRD進行掃描，將所得圖譜與JCPDS標準卡片相比，確定樣品是否為四氧化三鐵晶體結構。

2.2.1.3 樣品含量測定 原子吸收光譜儀測定樣品中的鐵含量。

2.2.1.4 FT-IR分析粒子的表面結構 取適量真空干燥的樣品顆粒研細成粉末，加入KBr壓片，充分混合直至形成KBr小丸，用FT-IR分析粒子的表面結構。

2.2.1.5 樣品的總體平均粒徑測定 取適量磁流體樣品置于粒度儀比色杯中，采用動態激光粒度儀測定總體平均粒徑。

2.2.2 磁學性質研究

取適量磁流體樣品置于VSM儀內，測定磁化曲線。

2.2.3 傳遞性質研究

2.2.3.1 樣品溶液在家兔體內分布測定 取家兔21只，隨機分成7組，每只按1.25 ml/kg的劑量由耳緣靜脈注射樣品溶液，給藥后 0.5、1、2、3、6、9、12 h 后分別從耳緣靜脈收集全血1～2 ml，置于肝素抗凝的試管中，后處死家兔，剖取其心、肺、肝、脾、淋巴結，預處理后，用原子吸收光譜儀測定各標本中鐵含量。

2.2.3.2 組織標本中攝入的樣品粒子觀察 取肝、脾、肺、淋巴結標本，采用4%戊二醛固定，丙酮逐級脫水，環氧樹脂包埋，作50 nm左右的超薄切片，染色后電鏡觀察。

2.2.4 注射樣品前后肝淋巴結的增強效果

MR 掃描參數：SE 序列，T2WI（TR/TE 為 1 800/60 ms），矩陣 256×256，層厚 3 mm。

2.3 統計學分析

統計學分析采用SPSS 12.0軟件，實驗結果用平均值±標準差（±s）表示，組間差異采用t檢驗法進行比較。

2.4 結果

2.4.1 樣品的物理性質

2.4.1.1 TEM顯示，四氧化三鐵核心部分為分散均勻、圓整的顆粒，以TEM標尺100 nm，其粒徑不超過10 nm（6～8 nm），見圖 2。

圖2 樣品的TEM圖譜

2.4.1.2 XRD顯示，圖中出現一系列特征峰，分別為2.964（220）、2.525（311）、2.092（400）、1.717（422）、1.612（511）、1.478（440）、1.276（533），與四氧化三鐵JCPDS標準卡片的位置一致，可確定樣品核心為四氧化三鐵晶體結構，見圖3。

圖3 樣品的XRD圖譜（A：Fe3O4納米粒；B：樣品 1；C：樣品 2；D：樣品 3；E：樣品 4）

2.4.2 樣品鐵含量測定結果

原子吸收光譜儀測得樣品鐵含量為0.2 mmol/ml。

2.4.3 FT-IR分析結果

FT-IR分析結果顯示，外包葡聚糖的四氧化三鐵出現了一些新的吸收峰，如 3 300、2 925、1 636、1 427 cm-1及 1 011、1 111、1157 cm-1，與純葡聚糖粉末吸收峰位置大致相同，表明葡聚糖主要以氫鍵、范德華力及靜電作用等方式與四氧化三鐵納米粒子結合，見圖4。

圖4 樣品的FT-IR圖譜（A：Fe3O4納米粒；B：葡聚糖；C：樣品）

2.4.4 樣品的總體平均粒徑測定結果

動態激光粒度儀測得樣品的總體平均粒徑為33 nm。

2.5 樣品的磁學性質

VSM測得的樣品磁化曲線顯示，樣品矯頑力為0，無磁滯現象，表現為超順磁性，樣品飽和磁化強度為48.1 emu/g，見圖5。

圖5 樣品的磁化曲線圖譜

2.6 樣品的傳遞性質

2.6.1 鐵元素濃度測定結果

樣品注射后，鐵元素在兔子體內血循環時間較長，從血漿中清除較慢，6 h后血液中仍存在較高濃度鐵元素，另外，樣品注射后，鐵元素迅速分布至各器官組織，依次為脾、肝、肺、心、淋巴結，其中，脾肝富集量最高，而在淋巴結中，6 h后鐵元素含量達最高值，隨后保持穩定，分別見表1、圖6。

2.6.2 肝、脾、肺、淋巴結切片結果

組織標本的電鏡顯示，肝、脾、肺、淋巴結切片具有較高密度的粒狀物，為氧化鐵顆粒，見圖7。

2.7 T2WI信號結果

注射樣品后，可見肝、淋巴結在T2WI信號明顯降低，見圖8。

表1 鐵元素在家兔各臟器的動態分布（n=3，μg/g）

3 討論

USPIO作為一種新型的磁性納米生物材料，是一種理想的磁共振陰性對比劑，近年來，學者們研究了較多的制備方法，其中較為簡單有效且技術成熟者當屬化學共沉淀法[1]，本實驗采用共沉淀一步法，合成了USPIO樣品，并通過加水合肼、超聲振蕩等手段，使納米顆粒分散性更好，粒徑更小。XRD顯示，樣品核心為Fe3O4晶體結構，TEM顯示，Fe3O4分散均勻、圓整，粒徑在10 nm以下（6～8 nm），小于單疇超順磁性氧化鐵顆粒的理論臨界值25 nm[2]。裸露的Fe3O4納米粒易發生團聚、沉淀，為了增加其懸浮穩定性及生物相容性，通常需對其進行表面修飾，而葡聚糖是目前常用的殼層生物大分子，具有良好的親水性，因此，本實驗亦采用了葡聚糖進行表面修飾，FT-IR顯示，葡聚糖主要以氫鍵、范德華力及靜電作用等方式與Fe3O4納米粒緊密結合，形成穩定的磁流體[3]。包被后的Fe3O4納米粒懸浮穩定性好，外觀呈黑棕色，含量為0.2 mmol/ml，4℃冰箱放置2個月，未見絮凝及沉淀現象。外包葡聚糖的Fe3O4顆粒直徑一般在納米數量級，其顆粒大小不同將影響其磁特性、藥代動力學特性及體內的分布。目前，根據顆粒大小將超順磁性氧化鐵顆粒（SPIO）分為兩類[4]：一類是普通的SPIO，一般納米顆粒直徑＞50 nm；另一類是USPIO，最大直徑＜50 nm。本實驗動態激光粒度儀檢測表明，樣品的總體平均粒徑為33 nm，顆粒大小符合USPIO，與國外處于臨床試驗階段的AMI-227相似。VSM結果表明，樣品在外加磁場下有良好的磁響應性，飽和磁化強度為48.1 emu/g，高于MR對比劑要求的最低強度標準[5]，當撤消磁場后剩磁為0，無磁滯現象，由于此時每個粒子都是一個單磁疇，磁化方向產生無規則的變化，導致超順磁性的出現，滿足了作為磁共振造影劑的基本要求。至于樣品在體內的傳遞及分布情況，一般來說，USPIO由于其顆粒小，與血漿蛋白和調理素的作用減弱，血循環半衰期延長，故可通過毛細血管壁更廣泛地分布于組織中，特別是通過毛細血管末梢進入骨髓，并通過淋巴管輸送到淋巴結[6]。筆者以家兔為對象進行了試驗，結果表明，鐵元素在兔子體內的血循環時間確實較長（＞6 h），從血中清除較慢，另外，樣品注射后，鐵元素迅速分布至各組織，如脾、肝、肺、心、淋巴結，其中，脾、肝富集量最高，而在淋巴結中，6 h后鐵元素含量達最高值，隨后保持穩定，因此，USPIO易沉積在網狀內皮細胞豐富的組織中，是一種網狀內皮系統的對比劑，可用于肝、脾，特別是淋巴結的MR增強[7]。當USPIO顆粒分布于組織后，由于具有很強磁矩，可局部擴增外加磁場，使磁場不均勻，水分子彌散穿過不均勻磁場時加速了質子的失相，造成了組織的T2明顯縮短，信號減低，目前主要用于T2WI成像（負性增強），而對T1影響較小（低濃度時亦有T1增強效應，高濃度時磁化率效應一定程度平衡了T1效應）[8]，本實驗發現，注射樣品后肝實質及淋巴結信號強度在T2WI上明顯下降，提示本樣品確實可作為肝、脾、淋巴結等網狀內皮系統MR的陰性對比劑。

綜上所述，利用共沉淀一步法制得的本樣品符合USPIO特點，具有良好的物理磁學性質及傳遞特性，USPIO的增強掃描為其廣泛用于肝、脾、淋巴結等網狀內皮系統疾病的診斷奠定了基礎。

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Preparation and performance study on ultrasmall superparamagnetic iron oxide(USPIO)nanoparticles

LIU Guohua1,CHEN Yanming1,CAI Qing2,CHEN Xiaojun1,HONG Ruoyu3
(1.Department of Respiration,East－section of the Affliated Suzhou Municipal Hospital of Nanjing Medical University,Suzhou 215001,China;2.Department of Radiology,East－section of the Affliated Suzhou Municipal Hospital of Nanjing Medical University,Suzhou 215001,China;3.Department of Chemistry and Chemical Engineering,Suzhou University,Suzhou 215123,China)

Objective:To study the physical,magnetic and transportable properties of USPIO nanoparticles prepared in our laboratory and explore its possibility for using as negative contrast agents in MRI.Methods:The iron oxide nanoparticles was obtained by means of co－precipitation one－step method,its inner crystal structure was analyzed by X－ray diffraction(XRD),its surface structure was analyzed by Fourier transform infrared(FT－IR),its size was measured by transmission electron microscopy(TEM)and dynamic loser scattering system,and its susceptibility was measured by vibrating sample magnetometer(VSM).The iron content in blood and various organ in rabbits at different time was measured by atomic absorption spectrometer,the enhancing－effect of liver and lymph after injecting sample was observed by MRI.Results:The diameter of dextran－coated iron oxide nanoparticles was 6－8 nm,its overall diameter was 33 nm,the iron content of sample was 0.2 mmol/L.These particles possed some characteristics of superparamagnetic,saturation magnetic intensity was 48.01 emu/g.The circulation time of sample in blood plasma of rabbit was long,it distributed in some organs,such as spleen,liver,lung,heart and lymph which had abundant of reticuloendothelial cells.The signal of T2－weighted MR images of liver and lymph decreased remarkably.Conclusion:The experimental conclusion shows the sample USPIO can be used as a promising negative MR agent for various types of liver,spleen and lymph diseases diagnosis.

USPIO;Physical property;Magnetic property;Transportable property;Negative contrast agents in MRI

R394

A

1673-7210（2010）07（a）-033－05

2010-03-31）

南京醫科大學科技發展基金(編號：NY0586)。

劉國華，男，江蘇蘇州人，醫學碩士，副主任醫師，研究方向為腫瘤基礎與臨床。