帕金森病模型大鼠行為學改變與黒質致密部多巴胺能神經元存活率之間的相關性

劉麗敏，李博，孫作厘，賈軍，汪璇，王曉民

(首都醫科大學基礎醫學院生理學系，教育部神經變性病重點實驗室，北京 100069)

研究報告

帕金森病模型大鼠行為學改變與黒質致密部多巴胺能神經元存活率之間的相關性

劉麗敏，李博，孫作厘，賈軍，汪璇，王曉民

(首都醫科大學基礎醫學院生理學系，教育部神經變性病重點實驗室，北京 100069)

目的探討線刀損毀內側前腦束建立的帕金森病模型大鼠行為學改變與黒質致密部多巴胺能神經元存活率之間的相關性。方法采用可伸縮線刀切斷大鼠內側前腦束建立單側損傷的帕金森病大鼠模型;皮下注射阿樸嗎啡后測試大鼠的旋轉行為;取中腦黑質切片進行酪氨酸羥化酶免疫組織化學染色，通過計數黑質致密部酪氨酸羥化酶陽性神經元的數目得到多巴胺能神經元存活率。結果模型組大鼠損傷側酪氨酸羥化酶陽性神經元的數目明顯下降，而由阿樸嗎啡誘導的旋轉行為明顯增加。結論線刀損毀術后4周，帕金森病模型大鼠由阿樸嗎啡誘導的旋轉行為和黒質致密部多巴胺能神經元存活率之間存在著明顯的負相關。

帕金森病;內側前腦束;阿樸嗎啡;多巴胺能神經元

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是繼阿爾茨海默病后第二大常見的中樞神經系統退行性疾病，其主要病理改變為黑質致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經元的漸進性死亡，導致紋狀體內DA含量降低，當DA含量減少到正常值的10%～30%時，即出現以靜止性震顫、運動遲緩、肌肉僵直為特征的臨床癥狀［1］。過去的二十年中，盡管臨床實驗以及在體和離體動物實驗使PD的病因學和病理學的研究取得了很大進展，但是PD發生的分子和細胞學機制仍然不是很清楚，因此研究者們仍然需要依賴動物模型對其病因學和病理學進行研究。在本實驗中我們采用機械切斷單側內側前腦束(medial forebrain bundle，MFB)的方法建立PD大鼠模型，研究PD模型大鼠由阿樸嗎啡(apomorphine，APO)誘導的旋轉行為和黒質致密部DA能神經元存活率之間的關系，以期為判斷PD的病情進展及各種治療方法的療效等研究提供客觀依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:健康Wistar雄性大鼠(SPF級)，體質量220～240 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供【SCXK(軍)2007－004】，無菌手術在首都醫科大學實驗動物科學部屏障動物實驗設施進行【SYXK(京)2005－0022】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.1.2 主要試劑:水合氯醛(北京化學試劑公司);阿樸嗎啡，小鼠單克隆抗TH抗體(Sigma公司); ABC－4002免疫組化試劑盒，ZLI9032 DAB顯色試劑(北京中杉金橋技術有限公司)。其他常規試劑主要為國產分析純。

1.1.3 主要儀器:大鼠腦立體定位儀，可伸縮線刀(美國KOPF公司);大鼠旋轉行為記錄儀(美國Columbus Instruments);冰凍切片機(德國Leica公司);普通光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 實驗方法

健康成年雄性W istar大鼠50只，隨機分為Sham(假手術對照)組和PD模型組。兩組大鼠于術后第4周末檢測由APO誘發的旋轉行為，行為學檢測結束后2 d，經左心室灌流固定，取腦組織冰凍切片，進行酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)免疫組化染色，計數黒質致密部TH陽性神經元的數量。模型組選取向未損傷側凈旋轉圈數大于40 r/ 30 min的大鼠，將其旋轉圈數與黒質致密部TH陽性神經元存活率之間做相關性分析。

1.2.1 大鼠腦立體定位手術:大鼠腹腔內注射6%的水合氯醛將其麻醉(350 mg/kg，i.p.)，俯臥位固定于腦立體定位儀上。消毒皮膚，暴露顱骨，調整門齒桿，使前、后囟位于同一水平面。在前囟后3.8 mm、矢狀線右側旁2.4 mm處，用牙科鉆鉆透顱骨，然后緩慢地將Scoutern線刀套管進到硬膜下8.0 mm，旋動旋鈕，將線刀從針管中伸出2.0 mm，然后將線刀上移3.0 mm，再回到原處，重復2次，緩慢收刀，退出套管，縫合皮膚。

1.2.2 旋轉行為測試方法:先給大鼠穿上束縛套后置于旋轉行為測試儀中適應約5 m in，待大鼠安靜后皮下注射APO(0.5 mg/kg)，給藥5 m in后由旋轉行為測試儀開始統一記錄，設定測轉時間為30 m in。旋轉行為的表示方法:以向左側(非損傷側)旋轉與向右側(損傷側)旋轉總轉數的差值為凈旋轉次數。測試時注意保持測試環境安靜與黑暗。

1.2.3 免疫組織化學染色:于大鼠腹腔內注射10%的水合氯醛將其深麻醉，剖開胸腔暴露心臟，經左主動脈灌流150 m L 37℃的生理鹽水，隨后灌流200 m L冰冷的4%多聚甲醛。打開顱骨取出全腦，置于4%多聚甲醛中后固定6 h，隨后用20%和30%的蔗糖溶液梯度沉淀腦組織。自蔗糖溶液中取出腦組織，OCT包埋，用冰凍切片機進行中腦切片，厚度為35 μm。每隔6張切片取一張，共留取切片6組，每組至少留有6～8張切片。切片浸入磷酸緩沖液(PBS，以下均為0.01 mol/L，pH 7.4)，5 m in×3次→0.3%Triton X－100，室溫30 m in→PBS，5 m in×3次→0.3%H2O2，室溫30 m in→PBS，5 m in×3次→10%正常馬血清，室溫15 m in→吸去馬血清，滴加小鼠抗大鼠TH單克隆一抗(1∶10 000)，4℃，24 h→PBS，5 m in×3次→滴加馬抗小鼠二抗(1∶200)，室溫2 h→PBS，5 m in×3次→HRP標記的鏈霉卵白素，37℃，30 m in→PBS，5 min×3次→DAB顯色液顯色約5 m in→PBS→梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每只大鼠至少取6張切片進行黑質致密區(substantia nigra pars compacta，SNpc)TH陽性細胞計數，并計算每只大鼠右側和左側陽性細胞數的比值。

1.2.4 統計學方法:采用GraphPad Prism 4.0軟件進行統計分析及作圖，數據以(±s)表示，兩組數據間差異用成組設計的兩樣本均數的t檢驗。以P＜0.05作為統計學差異的界限。

2 結果

2.1 PD模型大鼠黑質致密部TH陽性神經元免疫組化結果

TH免疫組化染色結果顯示(圖1，彩插5)，術后4周Sham組大鼠損傷側(右側)和未損傷側(左側)黑質致密部TH陽性神經元的存活率沒有明顯差別，而模型組大鼠損傷側黑質致密部TH陽性神經元數量明顯減少，分布稀疏，殘存神經元數量為未損傷側的(60.55±8.16)%(P＜0.01)。

2.2 阿樸嗎啡誘發的大鼠旋轉行為與黑質致密部TH陽性神經元存活率之間的相關性

術后4周APO可誘發Sham組大鼠出現向兩側的輕度旋轉行為，但左右側旋轉次數幾乎相同，在本實驗中其平均凈旋轉次數為(4.25±6.63)r/30 m in。在模型組大鼠中，向未損傷側凈旋轉圈數大于40 r/30 min的為15只，占模型組大鼠總數的60%。統計學結果顯示大鼠由APO誘發的旋轉行為與黑質致密部TH陽性神經元存活率之間呈明顯的負相關(R2=0.53，P＜0.01)。如圖2。

圖2 阿樸嗎啡誘發的大鼠旋轉行為與黑質致密部TH陽性神經元存活率之間的相關性Fig.2 Correlation of apomorphine－induced rotations and dopam inergic neuron survival rate in the SNpc of parkinsonian rat model.Statistical analysis revealed a significant inverse correlation between the number of rotations over 30 min after the apomorphine injection and the decreased TH－positive neurons survival rate 4 weeks after MFB axotomy.R2，coefficient of determination.

3 討論

在疾病的研究過程中，一個好的動物模型不僅能幫助我們進一步解釋疾病病因學的根本機制，而且有助于新的神經保護藥物和治療策略的研究發展，為基礎研究和應用研究提供必不可少的工具。現在PD研究中常用的動物模型主要包括化學損傷模型、機械損毀模型和轉基因動物模型，其中化學損傷模型應用最為廣泛，所用的神經毒素主要包括6－OHDA、MPTP和魚藤酮等［2］。6－OHDA是第一個被用來選擇性誘導DA能神經元死亡的神經毒素，它可通過介導細胞氧化應激等反應導致黑質DA能神經元死亡，最終引發黑質－紋狀體通路功能減退并產生類PD癥狀［3］，但其毀損模型產生的效應一般為急性的，有研究報道6－OHDA注入黑質和MFB后24h之內DA神經元開始死亡，95%的神經元于3d內死亡［4］，明顯不同于人類PD緩慢進展的病理特點，因此該模型常被用來模擬晚期PD的病理改變，多用于細胞移植和基因治療等實驗研究。MPTP是目前最為常用的制備PD動物模型的神經毒素，MPTP靈長類模型在病理、生化及癥狀方面均與人類PD表現相似［5，6］，是目前最合適的動物模型之一，但由于經濟、倫理道德等原因，靈長類模型還只在世界上少數幾個實驗室應用。目前最為普遍應用的MPTP模型為小鼠模型，但其各方面均不及靈長類模型經典，病變過程通常是急性且可逆的，無法完全模擬PD的發病特點。近年來也建立了很多轉基因動物模型，但這些模型制備過程復雜、技術要求高和費用昂貴。

本實驗中我們采用的PD模型為可伸縮線刀切斷單側MFB建立的機械損毀大鼠模型。MFB為黑質DA能神經元發出的傳出纖維投射到紋狀體的通路，此通路是紋狀體DA的主要來源，紋狀體合成的神經營養因子也是通過這條通路以逆軸漿轉運的方式到達SNpc，維持DA能神經元的存活。因此損傷MFB后不僅可造成軸突末梢的變性還可造成DA能神經元因缺乏逆向的營養支持而死亡。Knusel［7］和Lapchak［8］曾報道在MFB損傷后第18和19天損傷側DA能神經元的死亡率分別為44%和50%，而且這種單側MFB切斷并不影響對側TH陽性神經元的數量。Brecknell等［9］則通過逆向追蹤發現MFB損傷側的黑質神經元在損傷后1周時有28%的神經元死亡，隨后呈進行性丟失，在第10周時黒質神經元死亡率達到最大，在此時只有29%的神經元存活。這些結果表明該模型DA能神經元的死亡是漸進性的，能較好地模擬PD病程長、進行性發展的病變特點，但這些研究并未闡明DA神經元死亡數量和模型大鼠異常行為之間的關系。

行為學作為一種直觀可靠的指標，在PD的發病機制研究、病程監測及療效評價中發揮著重要作用。臨床資料顯示PD患者的主要行為學改變為靜止性震顫、肌肉僵直和運動遲緩等。單側切斷MFB所建立的PD模型大鼠同樣可出現行為學的改變，如平衡協調能力下降及可出現由藥物誘發的旋轉行為等。在本實驗中，注射APO能誘發Sham組大鼠向兩側的輕度旋轉行為，左右側旋轉次數幾乎相同，而模型組大鼠向未損傷側的旋轉行為明顯增加。一般認為，模型組大鼠旋轉行為增加的機制是黑質DA能神經元損傷、變性到一定程度，由于DA遞質釋放量的急劇降低，引起紋狀體突觸后膜DA受體超敏。注射APO后可以強烈地激活損傷側紋狀體內的DA受體，使動物向健側旋轉。本實驗結果首次表明，線刀損毀MFB建立的帕金森病模型大鼠的異常旋轉行為與黑質致密部TH陽性神經元存活率之間呈明顯的負相關。TH是DA合成的限速酶，存在于DA能神經元的胞質內，通過TH免疫組化染色法可判斷DA能神經元的數目。因此在以后的實驗中，我們可以通過線刀損毀MFB建立的PD模型大鼠的異常旋轉行為判斷黑質致密部DA能神經元存活率，如根據圖2所示，當模型大鼠旋轉圈數為130 r/30 min時，黑質致密部DA能神經元存活率約為50%，從而為監測PD的病情進展及各種治療方法的療效提供直觀的指標。

(本文圖1見彩插5。)

［1］Dauer W，Przedborski S.Parkinson's disease:mechanisms and models［J］.Neuron，2003，39(6):889－909.

［2］Bove J，Prou D，Perier C，et al.Toxin－induced models of Parkinson's disease［J］.NeuroRx，2005，2(3):484－494.

［3］王濤，左萍萍.帕金森病實驗動物模型研究進展.中國神經免疫學和神經病學雜志［J］.2008，15(6):455－457.

［4］Schmidt H，Bj?rklund A，Stenevi U，et al.Intracerebral grafting of neuronal cell suspensions.III.Activity of intrastriatal nigral suspension implants as assessed by measurements of dopamine synthesis and metabolism［J］.Acta Physiol Scand. Suppl，1983，522:19－28.

［5］Brownell AL，Canales K，Chen YI，et al.Mapping of brain function after MPTP－induced neurotoxicity in a primate Parkinson’s disease model［J］.Neuroimage，2003，20(2): 1064－1075.

［6］Brownell AL，Jenkins BG，Elmaleh DR，et al.Combined PET/ MRS brain studies show dynamic and long－term physiological changes in a primate model of Parkinson disease［J］.Nat Med，1998，4(11):1308－1312.

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［8］Lapchak PA，Beck KD，Araujo DM，et al.Chronic intranigral administration of brain－derived neurotrophic factor produces striatal dopaminergic hypofunction in unlesioned adult rats and fails to attenuate the decline of striatal dopaminergic function following medial forebrain bundle transection［J］.Neuroscience，1993，53(3):639－650.

［9］Brecknell JE，Dunnett SB，Fawcett JW.A quantitative study of cell death in the substantia nigra following a mechanical lesion of the medial forebrain bundle［J］.Neuroscience，1995，64(1): 219－227.

Correlation of Behavioral Changes and Survival Rate of Dopam inergic Neurons in the Substantia Nigra Pars Com pacta in Parkinsonian Rat M odel

LIU Li－min，LI Bo，SUN Zuo－li，JIA Jun，WANG Xuan，WANG Xiao－min
(Department of Physiology，School of Basic Medical Sciences，Capital Medical University，Key Laboratory of Neurodegenerative Diseases of the M inistry of Education，Beijing 100069，China)

ObjectiveTo exp lore the correlation of behavioral changes and survival rate of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta(SNpc)in parkinsonian rat model.M ethods The parkinsonian rat model was established by mechanical transection of the nigrostriatal dopamine pathway at the medial forebrain bundle(MFB). Behavioral studies were carried out by apomorphine challenge.Immunohistochemistry was applied on the tissue sections of substantia nigra(SN).The number of dopaminergic neurons was determined by counting the tyrosine hydroxylase(TH)－positive neurons in the sections.ResultsImmunohistochem ical studies confirmed a significant loss of TH－positive neurons on the lesioned side，while the rotations induced by apomorphine increased remarkably in the parkinsonian rat model..Conlusions At 4 weeks after the surgery，there is a significant inverse correlation between the number of apomorphineinduced rotations and the decreased survival rate of neurons in parkinsonian rat models established by mechanical transection of the nigrostriatal dopamine pathway at the medial forebrain bundle.

Parkinsonian rat model;MFB;Apomorphine;Dopaminergic neurons;Behavioral changes

Q－189

A

1005－4847(2010)05－0394－04

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.05.007

2010－04－21

國家自然科學基金(編號:30472245);首都醫科大學基礎臨床科研合作基金(編號:10JL14)。

劉麗敏(1973－)，女，研究方向:帕金森病發病機制及防治研究。E－mail:liulimincn@yahoo.com.cn

王曉民。E－mail:xmwang@ccmu.edu.cn