復元膠囊對硝普鈉誘導的軟骨細胞凋亡與細胞周期作用的實驗研究

周小莉，李榮亨（重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科，重慶市 400016）

復元膠囊對硝普鈉誘導的軟骨細胞凋亡與細胞周期作用的實驗研究

周小莉＊，李榮亨#（重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科，重慶市 400016）

目的：研究復元膠囊含藥血清對硝普鈉（SNP）誘導的軟骨細胞凋亡與細胞周期的作用。方法：雄性3周齡SD大鼠，用于分離培養軟骨細胞；雄性成年SD大鼠，用于制備含藥血清。將第2代的軟骨細胞進行分組實驗。透射電鏡觀察軟骨細胞凋亡的超微結構，流式細胞儀檢測細胞周期百分率及細胞凋亡率，硝酸還原酶法檢測培養液中NO含量。結果：復元膠囊含藥血清可使SNP誘導的軟骨細胞處于G0/G1期的百分比減少，S期及G2/M期的百分比增加（P＜0.05，P＜0.01）；可使細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），培養上清中NO含量顯著降低（P＜0.05）。結論：復元膠囊含藥血清能顯著降低SNP誘導的軟骨細胞凋亡率，促進細胞增殖，并降低培養液中NO的含量，這可能是復元膠囊防治骨性關節炎的作用機制之一。

復元膠囊；軟骨細胞；中藥；細胞凋亡；細胞周期；一氧化氮

關節軟骨退行性病變是骨關節炎（Osteoarthritis，OA）發病的中心環節，近年研究表明，隨著增齡，關節軟骨細胞凋亡增加，細胞密度顯著降低，軟骨變性、丟失，繼之鄰近軟骨增生、骨化而形成骨關節病變，故軟骨細胞凋亡在關節軟骨退行性改變過程中起著重要作用[1，2]。復元膠囊是臨床上長期用于治療OA有明顯療效的中藥復方醫院制劑，由人參、淫羊藿、鹿茸、黃芪、川芎、當歸、枸杞子等組成，具有補益肝腎、益氣活血之功效，對氣虛血瘀證患者癥狀、血液流變學有改善作用，可緩解疼痛，改善OA關節功能[3]，但其作用機制尚不十分清楚。本研究采用透射電鏡、流式細胞儀及硝酸還原酶法觀察復元膠囊含藥血清對硝普鈉（Sodium nitroprusside，SNP）誘導的體外培養的軟骨細胞凋亡、細胞周期以及培養上清中一氧化氮（Nitric oxide，NO）水平的影響，探討其防治OA的作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SW-CJ-2A型凈化工作臺（重慶匯誠空調凈化設備制造公司）；2001-13型二氧化碳培養箱（上海常思工貿有限公司）；IX-700型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；FACS Calibur流式細胞分析儀（美國Becton Dickinson公司）；HITACHI-7500型透射電鏡（日本Hitachi公司）；生物分光光度計（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

復元膠囊委托重慶希爾安藥業有限責任公司制成膠囊，僅供實驗使用（批號：090312）；SNP（北京雙鶴現代醫藥技術有限責任公司，批號：H111021635）；DMEM/F12 1∶1培養基（FD培養基）、胎牛血清（美國Hyclone公司）；Ⅱ型膠原酶（美國Sigma公司）；胰蛋白酶（美國Gibico公司）；PBS緩沖液（北京中杉金橋生物技術有限公司）；碘化丙錠（PI）染色劑（深圳晶美生物工程有限公司）；NO硝酸還原酶法試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 動物

3周齡SD大鼠10只，♂，體質量40～60 g；成年SD大鼠30只，♂，體質量200～250 g，均由重慶醫科大學實驗動物中心提供（動物生產許可證號：SYXK（渝）2002007）。

2 方法

2.1 軟骨細胞的分離、培養及傳代[4]

將3周齡SD大鼠斷頸處死后，無菌條件下分離出股骨頭軟骨，盡量剔除周圍組織，浸入含青霉素和鏈霉素的雙抗水中漂洗3次，浸入FD培養基中漂洗3次，再次清除軟骨周圍附帶組織，將軟骨剪成1 mm3大小，移入0.25%胰蛋白酶中，放入37℃水浴箱中消化30 min，胎牛血清終止消化，PBS緩沖液清洗2遍，再加入0.2%Ⅱ型膠原酶中，放入37℃水浴箱消化4 h成絮狀，其間每30 min輕輕搖蕩1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，PBS緩沖液清洗2遍，加入含15%胎牛血清FD培養基制成細胞懸液，用200目不銹鋼篩網過濾后接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱進行原代培養。原代細胞長滿80%后傳代培養。用于實驗的軟骨細胞為第2代的傳代細胞。

2.2 含藥血清的制備

成年SD大鼠30只，隨機分成2組，即復元膠囊組（20只）、空白組（10只）。復元膠囊組按Meeh-Rubner公式給予等效劑量10倍量藥物，充分溶于生理鹽水；空白組給予等劑量的生理鹽水，ig給藥，每天2次，連續3 d。末次ig后2 h腹主動脈取血，4 ℃靜置過夜，3 000 r·min-1離心20 min，取上清，經0.22μm抽濾器除菌后，分裝，－20℃貯藏，備用。

2.3 分組

選用第2代軟骨細胞種植于培養瓶中培養24 h，待細胞貼壁后，用不含血清的FD培養基“饑餓”培養24 h，使細胞同步化。分為空白組（FD培養基培養）、模型組（2 mmol·L-1SNP+FD培養基培養）、10%空白血清組（2 mmol·L-1SNP+10%空白血清+FD培養基培養）、5%復元膠囊血清組（2 mmol·L-1SNP+5%復元膠囊含藥血清+FD培養基培養）、10%復元膠囊血清組（2 mmol·L-1SNP+10%復元膠囊含藥血清+FD培養基培養）、20%復元膠囊血清組（2 mmol·L-1SNP+20%復元膠囊含藥血清+FD培養基培養）。

2.4 透射電鏡觀察軟骨細胞凋亡的超微結構

按“2.3”項下進行分組，繼續培養48 h后，收集培養上清，用胰酶將細胞消化后收集于離心管。在4℃條件下以2 000 r·min-1離心成細胞團塊，用2.5%戊二醛固定2 h，1%四氧化鋨再固定1.5 h，經梯度丙酮脫水，環氧樹脂浸透包埋，超薄切片機切片，電子染色，透射電鏡下觀察。

2.5 流式細胞儀分析細胞周期

收集細胞（酶消化法），PBS洗滌1遍，加70%乙醇，振蕩（4℃貯藏）。上機前離心去除固定液，PBS洗2遍，加1 mL PBS重懸細胞，加20 μL RNAse（10 mg·mL-1）使之終濃度為200 μg·mL-1，37 ℃放置30 min以上。加入碘化丙啶，使其終濃度為50 μg·mL-1，避光30 min；300目尼龍網過濾，于流式細胞儀檢測，計數10 000個細胞，分析細胞周期。

2.6 流式細胞分析法檢測軟骨細胞凋亡

用胰酶將細胞消化后，收集于離心管。在4℃條件下以2 000 r·min-1離心成細胞團塊，按AnnexinV-FITC/PI試劑盒說明書進行操作，采用FACS Aria流式細胞分析儀檢測，每個樣本檢測計數的細胞數量均固定為10 000個，應用CEL LQuest軟件獲取、分析輸出實驗數據。

2.7 硝酸還原酶法檢測培養血清中NO濃度

收集各組培養液，采用硝酸還原酶法檢測血清中NO濃度，操作按說明書進行，并按照試劑盒說明書推薦的公式計算NO含量。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 原代培養軟骨細胞形態

原代軟骨細胞接種時為圓形懸浮狀態。48 h后，細胞大部分貼壁，呈圓形或橢圓形，體積較小。經Ⅱ型膠原細胞免疫組化鑒定為軟骨細胞。軟骨細胞形態見圖1。

圖1 軟骨細胞形態A.倒置顯微鏡（×100）；B.SP染色（×200）Fig 1 Morphology of chondrocyteA.inverted microscope（×100）；B.SP（×200）

3.2 透射電鏡下對軟骨細胞超微結構的觀察

正常軟骨細胞核完整，核膜清晰，核內染色質均勻分布，粗面內質網呈層狀排列，線粒體散在分布，細胞表面有許多微絨毛突起。早期凋亡細胞體積縮小，細胞膜完整，細胞表面的微絨毛明顯減少，甚至消失，細胞漿致密，細胞器完整，核染色質濃縮，集聚于核膜下；中晚期凋亡細胞體積明顯縮小，核膜發生皺褶，胞質密度增高，有典型的凋亡小體，內有細胞器，細胞周圍可見脫落的凋亡小體；壞死細胞腫脹，不完整，細胞質內可見水泡，甚至細胞溶解，無完整的細胞器。模型組軟骨細胞主要為凋亡細胞和壞死細胞，可見少量正常細胞；中藥組以正常細胞和早期凋亡細胞為主。

3.3 復元膠囊含藥血清對軟骨細胞周期的影響

與模型組和空白組血清比較，復元膠囊血清處理后的細胞處于G0/G1期的百分比減少，S及G2/M期的百分比增加，增殖指數（PI）顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。3個濃度復元膠囊血清，以10%的復原膠囊血清作用最顯著。復元膠囊含藥血清對軟骨細胞周期的影響見表1。

圖2 軟骨細胞超微結構（TEM×6 000）A.正常細胞；B.早期凋亡細胞；C.中晚期凋亡細胞；D.壞死細胞Fig 2 The ultrastructure of chondrocyte（TEM×6 000）A.normal cells；B.apoptosis cells in the early stage；C.apoptosis cells in advanced stage；D.necrotic cells

表1 復元膠囊含藥血清對軟骨細胞周期的影響（±s）Tab 1 Effects of serum containing Fuyuan capsule on cell cycle progression of chondrocyte（±s）

表1 復元膠囊含藥血清對軟骨細胞周期的影響（±s）Tab 1 Effects of serum containing Fuyuan capsule on cell cycle progression of chondrocyte（±s）

與空白組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組10%空白血清組5%復元膠囊血清組10%復元膠囊血清組20%復元膠囊血清組PI/%15.81±1.51 6.62±1.14＊20.95±1.40#22.61±1.23＊＊#29.20±1.70＊#23.10±0.74＊#n 5 5 5 5 5 5 G0/G1/%85.18±1.58 93.40±1.14＊80.05±0.71#77.39±1.23＊＊#70.60±1.38＊#76.50±1.21＊##S/%5.30±0.63 3.50±0.35＊＊10.30±0.75#11.57±0.96#17.42±0.42＊#14.21±1.10＊#G2/M/%9.70±0.15 3.31±0.17＊＊9.90±0.65#11.20±0.84#11.74±1.38＊#9.10±0.39＊#

3.4 復元膠囊含藥血清對SNP誘導的軟骨細胞凋亡及培養液中NO含量的影響

與模型組血清比較，復元膠囊含藥血清組細胞凋亡率顯著降低，培養液中NO含量顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）。3個濃度復元膠囊血清，以10%、20%的血清作用最顯著，但兩者之間差異無統計學意義（P＞0.05）。復元膠囊含藥血清對軟骨細胞凋亡及培養液中NO含量的影響見表2。

4 討論

OA在祖國醫學屬于“痹證”、“骨痹”范疇，腎元虧虛、肝血不足、氣虛血瘀是導致本病的根本內因。中醫藥治療OA有著悠久的歷史，因其效果顯著、副作用小、適合長期治療而獨具優勢。復元膠囊是臨床上長期用于治療OA有明顯療效的中藥復方制劑，筆者前期工作發現，復元膠囊含藥血清可促進正常軟骨細胞的增殖、DNA及Ⅱ型膠原合成[5]。本實驗從復元膠囊對軟骨細胞凋亡的角度進一步探討其作用機制。

OA是以關節軟骨基質降解為特征的退行性關節疾病，軟骨細胞過度凋亡在其發病過程中起著重要作用。本研究結果表明，經SNP誘導的軟骨細胞在透射電鏡下可觀察到典型的凋亡形態，包括細胞體積縮小、染色質凝聚、核碎片、細胞皺縮、凋亡小體等。流式細胞儀檢測發現，復元膠囊含藥血清能降低軟骨細胞凋亡率，與模型組及空白血清組比較，差異有統計學意義。復元膠囊含藥血清能抑制軟骨細胞的過度凋亡，可能是復元膠囊治療骨關節炎的重要機制之一。

表2 復元膠囊含藥血清對軟骨細胞凋亡及培養液中NO含量的影響（±s）Tab 2 Effects of serum containing Fuyuan capsule on the SNP-induced apoptosis of chondrocytes and NO in the culture supernatant（±s）

表2 復元膠囊含藥血清對軟骨細胞凋亡及培養液中NO含量的影響（±s）Tab 2 Effects of serum containing Fuyuan capsule on the SNP-induced apoptosis of chondrocytes and NO in the culture supernatant（±s）

與空白組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組10%空白血清組5%復元膠囊血清組10%復元膠囊血清組20%復元膠囊血清組n 5 5 5 5 5 5細胞凋亡率/%1.94±0.15 39.73±1.10＊＊36.23±0.59##34.82±1.20＊＊##29.47±1.33＊#30.28±1.05＊#NO含量/μmol·L-1 26.53±1.58 153.11±5.08＊＊122.12±4.41#114.46±7.34#81.03±7.87＊#85.93±3.99＊#

細胞周期與細胞中DNA含量密切相關，DNA含量隨著細胞周期的各期而發生變化。細胞的周期分布能夠反映細胞增殖的具體過程。PI是S期與G2期DNA含量之和同S期、G2期及G1期DNA含量之和的比值，它與S期百分比是反映細胞增殖的重要指標[6]。本研究結果顯示，復元膠囊血清處理后的細胞處于G0/G1期的百分比減少，S期及G2/M期的百分比增加，PI明顯增加，表明復元膠囊能調節細胞周期分布，促進細胞增殖。

用NO供體SNP誘導建立軟骨細胞凋亡模型已成為一種常用的實驗手段[7]。研究發現SNP誘導細胞凋亡可能存在以下關系：低濃度時抑制細胞凋亡，高濃度時引起細胞凋亡，過高濃度時引起細胞壞死[8]。而OA關節中NO抑制軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞凋亡，使關節軟骨中細胞數量減少，關節修復功能下降[9]。所以，通過抑制NO的產生來抑制軟骨細胞的過度凋亡可能是一條治療OA的途徑。本研究結果顯示，2 mmol·L-1濃度的SNP作用于軟骨細胞48 h能誘導軟骨細胞凋亡率升高，伴隨有培養液中NO濃度增加。當筆者用復元膠囊含藥血清干預后，軟骨細胞凋亡率明顯降低并伴有培養液中NO含量降低，提示復元膠囊可能通過降低NO含量而抑制軟骨細胞過度凋亡。

本研究初步揭示了復元膠囊含藥血清抑制軟骨細胞凋亡、調節凋亡細胞周期的作用，但只是在細胞水平上的闡述。至于其有效成分是如何抑制細胞凋亡，它作用于細胞膜上的何種受體，以及信號如何在細胞內進行傳導，是需要進一步研究的問題。

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Effects of Fuyuan Capsule on SNP-induced Apoptosis of Chondrocyte and Cell Cycle Progression

ZHOU Xiao-li，LI Rong-heng（Dept.of Integrated Traditional and Western Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To study the effects of the serum containing Fuyuan capsule on sodium nitroprusside（SNP）-induced apoptosis of chondrocyte in vitro and cell cycle progression.METHODS：The chondrocyte of 3-week-old male SD rats were separated and cultivated.Male SD rats were included in the preparation of serum containing Fuyuan capsule.The second generation of chondrocyte was involved in experiment.TEM and flow cytometer were adopted to observe ultrastructure of apoptotic chondrocyte and detect cell cycle progression and apoptosis rate.NO examination adopted nitrare reductase method.RESULTS：The serum containing Fuyan capsule could significantly decrease the percentage of SNP-induced apoptosis in G0/G1phase and increase percentage in S phase and G2/M phase（P＜0.05，P＜0.01）.The apoptosis of chondrocyte was decreased significantly（P＜0.05，P＜0.01）.The concentration of NO in the culture supernatants was reduces significantly（P＜0.05）.CONCLUSION：The serum containing Fuyuan capsule could promote proliferation of chondrocyte，inhibit SNP-induced apoptosis of chondrocyte，and reduce the concentration of NO in the culture supernatants.It is an important mechanism of Fuyuan capsule preventing osteoarthritis.

Fuyuan capsule；Chondrocyte；Traditional Chinese medicine；Apoptosis；Cell cycle；NO

R285.5；R97

A

1001-0408（2010）39-3661-04

2009-12-05

2010-04-12）