益智康腦丸對老年性癡呆大鼠行為學及腦組織Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

伍小燕，李茂（1.廣西中醫學院第一附屬醫院，南寧市 53003；.廣西中醫藥研究院，南寧市 5300）

益智康腦丸對老年性癡呆大鼠行為學及腦組織Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

伍小燕1＊，李茂2（1.廣西中醫學院第一附屬醫院，南寧市 530023；2.廣西中醫藥研究院，南寧市 530022）

目的：探討益智康腦丸對老年性癡呆（AD）大鼠行為學及腦組織凋亡蛋白的影響。方法：復制D-半乳糖AD大鼠模型。實驗分為4組，即空白、模型、益智康腦丸和腦復康組，檢測大鼠行為學及腦組織抑制細胞凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax表達指標的改變。結果：模型組與空白組比較，學習記憶能力顯著下降，Bcl-2/Bax比值下降；治療組與模型組比較，學習記憶能力顯著改善，Bcl-2/Bax比值增加。結論：益智康腦丸具有較好的治療AD作用，其機制可能與促進AD大鼠腦組織Bcl-2的表達、降低Bax的表達有關。

老年性癡呆；益智康腦丸；行為學；B細胞淋巴瘤/白血病-2；B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD），是指老年老化程度超過生理性老化，或過早老化，致使腦功能障礙，引起獲得性、持續性智能障礙，是以進行性癡呆為主要表現的神經退行性疾病。其首要癥狀是智力、記憶力、感官定向能力、判斷力、語言思維能力不可逆的進行性退化，并常伴有性格改變。益智康腦丸用于治療脾腎兩虧、腦髓空虛所致之老年性癡呆病，臨床應用多年，療效顯著。本研究旨在通過復制老年性癡呆大鼠模型，探討該方對模型大鼠行為學及神經細胞凋亡的影響，以進一步闡明其作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

腦立體定位儀（淮北正華公司）；被動回避反應箱（上海騏馳儀器有限公司）；CX31型顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試藥

益智康腦丸（廣西強壽藥業集團有限公司，批號：060901，每丸重3 g，由0.9%生理鹽水配制為所需濃度）；腦復康（天津金世制藥有限公司，批號：060318）；促進細胞凋亡基因Bax、抑制細胞凋亡基因Bcl-2免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.3 動物

健康Wistar大鼠40只，6～7周齡，♀♂兼用，體質量180～220 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供（生產許可證號：SCXK桂2003-0003）。

2 方法

2.1 模型的復制

[1]，采取D-半乳糖+喹啉酸（QA）法復制老年性癡呆大鼠模型。除空白組每日ip 0.5 mL生理鹽水外，其余各組每日ip 0.5 mL D-半乳糖（500 mg·kg-1），連續7周，復制大鼠衰老模型。7周后除空白組外，各組大鼠均用1%的戊巴比妥鈉麻醉，固定在腦立體定位儀上，暴露前囟，按腦立體定位圖譜鉆開顱骨，緩慢將微量注射器垂直進入到注射部位，注射lμL 75 nmol·μL-1的QA。注射完畢后，留針10 min，然后緩慢拔針，用牙科泥封堵顱骨上的鉆空。術后1周各組進行行為學測試。

2.2 分組及給藥

將40只大鼠隨機分為空白（等量生理鹽水）、模型（等量生理鹽水）、腦復康（0.7 g·kg-1）和益智康腦丸（4.5 g·kg-1）組。ig給藥，每天1次，連續給藥3周。術后進行1周行為學測試后給藥，連續ig 3周后再進行行為學測試。

2.3 行為學測試

采用跳臺法。跳臺裝置為一個25 cm×20 cm×75 cm的被動回避反應箱，箱底鋪直徑為1 mm的銅柵，通36 V交流電，銅柵的一角固定一個8 cm×8 cm×5 cm大小的塑料泡沫塊作為動物回避電擊反應的安全區。先將大鼠放入箱中自由活動5 min熟悉環境，然后接通銅柵電源，大鼠受到電擊后跳回安全區以躲避傷害性刺激，然后大鼠再次跳至銅柵上，受到電擊（雙足同時接觸銅柵）又跳回安全區，如此反復5 min，記錄每只大鼠首次找到安全區至第一次跳下安全區的時間（潛伏期）和5 min內受到的電擊次數（錯誤次數），作為測試結果。第1天為學習訓練期，其后連續7 d測試，記錄各組大鼠5 min內觸電潛伏時間及錯誤次數，計算其平均值。

2.4 腦組織Bcl-2、Bax含量的測定[2]

在行為學測試結束后，進行腦組織取材。大鼠經戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定頭及四肢，開胸暴露心臟，經左心室插管至主動脈，同時剪開右心耳，依次用Ringer液、4%多聚甲醛的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液200 mL灌注固定大鼠，注畢取腦，固定于苦味酸中12～24 h，石蠟包埋，切片，常規脫蠟至水，進行免疫組化染色。用蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min后進行微波抗原修復，用3%H2O2去離子水孵育5～10 min，以消除內源性過氧化物酶活性。滴加正常血清封閉液，室溫孵育10～15 min，傾去，勿洗。每張切片加入1∶200倍稀釋Bax、Bcl-2抗體，37℃孵育2 h，PBS沖洗后加入生物素化二抗工作液，37℃孵育10～15 min，PBS沖洗后加入辣根酶標記鏈霉卵白素，室溫孵育10～15 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片，顯微鏡觀察。鏡下觀察，細胞核與細胞漿內出現棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞，每組取8個切片，每個切片隨機取5個視野，計數陽性細胞，取平均值進行比較。

2.5 統計學方法

所有數據采用SPSS13.0統計軟件包進行統計分析。計量資料數據以±s 表示，組間比較采用方差分析；計數資料率的比較采用卡方檢驗。P＜0.05表示差異有顯著性。

3 結果

3.1 行為學測試結果

用藥前，與空白組比較，各組大鼠跳臺潛伏期均縮短，錯誤次數顯著增加（P＜0.05）；用藥后，與模型組比較，益智康腦丸組與腦復康組大鼠跳臺潛伏期均顯著延長，觸電錯誤次數顯著減少（P＜0.05），但兩藥物組之間比較無顯著差異（P＞0.05）。結果表明，益智康腦丸可以改善模型大鼠學習記憶能力。各組大鼠跳臺潛伏期比較見表1；各組大鼠跳臺錯誤次數比較見表2。

表1 各組大鼠跳臺潛伏期比較（±s）Tab 1 Comparison of latency in the step down tes（t±s）

表1 各組大鼠跳臺潛伏期比較（±s）Tab 1 Comparison of latency in the step down tes（t±s）

與空白組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

劑量/g·kg-1n組別空白組模型組益智康腦丸組腦復康組- -用藥后潛伏期/s 250.15±51.20 173.08±32.17＊216.68±43.37#220.14±30.75#4.5 0.7 10 10 10 10用藥前潛伏期/s 241.25±40.36 176.02±36.25＊180.14±40.81＊178.30±45.04＊

表2 各組大鼠跳臺錯誤次數比較（±s）Tab 2 Comparison of incorrect times in the step down test（±s）

表2 各組大鼠跳臺錯誤次數比較（±s）Tab 2 Comparison of incorrect times in the step down test（±s）

與空白組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

治療后錯誤次數4.3±1.4 9.9±1.8＊5.1±2.9#5.5±3.4#劑量/g·kg-1n組別空白組模型組益智康腦丸組腦復康組- -4.5 0.7 10 10 10 10治療前錯誤次數4.5±1.8 10.1±2.6＊7.9±1.6＊8.2±2.1＊

3.2 腦組織Bcl-2和Bax免疫組化結果

與空白組比較，模型組Bax、Bcl-2蛋白表達顯著增強（P＜0.01）；與模型組比較，益智康腦丸組與腦復康組Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著增強（P＜0.01），兩藥物組之間比較無顯著差異（P＞0.05）。結果表明，益智康腦丸能顯著抑制Bax蛋白表達，促進Bcl-2蛋白表達，從而抑制細胞凋亡。各組大鼠腦組織Bcl-2和Bax表達的比較見表3。

表3 各組大鼠腦組織Bcl-2和Bax表達的比較（±s）Tab 3 Comparison of the expression of Bcl-2 and Bax in cerebral tissue of rats（±s）

表3 各組大鼠腦組織Bcl-2和Bax表達的比較（±s）Tab 3 Comparison of the expression of Bcl-2 and Bax in cerebral tissue of rats（±s）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

組別空白組模型組益智康腦丸組腦復康組劑量/g·kg-1n- -Bcl-2/Bax 0.94 0.52 1.97 1.72 4.5 0.7 10 10 10 10 Bax 2.04±0.18 15.29±2.65＊8.26±2.04#8.51±3.06#Bcl-2 1.92±0.68 7.91±1.36＊16.31±3.19#14.62±2.94#

4 討論

近年來研究表明，細胞凋亡參與了中樞神經系統的退行性病變，與衰老和老年性癡呆的發生存在著密切聯系。老年性癡呆神經元凋亡的具體機制可能與凋亡相關蛋白表達失調等因素有關。細胞內與凋亡有關的基因分為2類：誘導凋亡基因和抑制凋亡基因。在神經細胞凋亡中，Bcl-2家族是不可缺少的，Bcl-2是重要的抗凋亡基因，在細胞色素C的釋放調控中起重要作用[2]。Bcl-2與Bax是一對相互拮抗的蛋白質，它們形成二聚體，拮抗對方的功能，Bcl-2具有明顯抑制凋亡作用，而Bax則促進凋亡。Bax和Bcl-2形成復合體而失去作用。由此可見，損傷刺激后，Bax和Bcl-2表達的比率在很大程度上影響凋亡的產生[3]。

益智康腦丸是立足于壯醫理論而成方，以壯族民間藥物五指毛桃根、扶芳藤為主藥，配合牛大力、千斤拔、紅參、熟地、肉蓯蓉、山藥等諸藥合用，共奏補脾腎、益精血、健腦髓、養“巧塢”之功，臨床用于治療腦髓空虛、“巧塢”失養之老年性癡呆、腦萎縮癥療效顯著[4]。本研究結果表明，造模后，在機體的一種自我保護機制下，Bcl-2蛋白表達反應性增強，同時啟動了凋亡程序，使Bax表達增強，促進細胞凋亡的發生。藥物干預后，Bcl-2表達增強，Bax表達減弱，抑制細胞凋亡。表明益智康腦丸對老年性癡呆的改善作用可能是通過上調Bcl-2蛋白、下調Bax蛋白的表達，抑制細胞凋亡而實現，從而改善老年性癡呆大鼠的學習記憶能力。

參考文獻

[1]齊曦明，韓玉生，周忠光，等.癡呆靈膠囊對老年癡呆大鼠學習記憶影響及其機制的實驗研究[J].中醫藥學報，2004，32（1）：45.

[2]Wnag HQ，Nakaya Y，Du ZY，et al.Interaction of presenilins with FKBP38 promotes apoptosis by reducing mitochondiral Bcl-2[J].Hum Mol Genet，2005，14（13）：1 889.

[3]Yao MZ，Nguyen TV，Pike C，et al.B-Amyloid-induced neuronal apoptosis involves c-jun N-terminal kinase-dependent downergulation of Bcl-w[J].Journal Neurosci，2005，25（5）：1 149.

[4]黃漢儒.中國壯醫學[M].南寧：廣西民族出版社，2000：12.

Effect of Yizhi Kangnao Pills on Ethology and the Expression of Bcl-2 and Bax in Cerebral Tissue of AD Rats

WU Xiao-yan（The First Affiliated Hospital of Guangxi College of TCM，Nanning 530023，China）
LI Mao（Guangxi Institute of TCM，Nanning 530022，China）

OBJECTIVE：To explore the effect of Yizhi kangnao pills on ethology and the expression of Bcl-2 and Bax in cerebral tissue of AD rats.METHODS：The D-galactose AD rat model was established.Rats were divided into blank group，model group，Yizhi kangnao pill group and Piracetam control group.The change of ethology and the expression of Bcl-2 and Bax in cerebral tissue were detected.RESULTS：Compared with blank group，the ability of learning and memory of rats in model group decreased significantly and the ratio of Bcl-2/Bax in the hippocampus came down.Compared with model group，the ability of learning and memory of rats in Yizhi kangnao pills group was improved significantly and the ratio of Bcl-2/Bax rose.CONCLUSION：The results show that Yizhi kangnao pills have good therapeutic effect on AD.The mechanism is associated with the improvement of the expression of Bcl-2 and reduction of the expression of Bax in cerebral tissue of AD rats.

AD；Yizhi kangnao pills；Ethology；Bcl-2；Bax

R285；R97

A

1001-0408（2010）39-3673-03

2010-06-11

2010-08-23）