莪術油葡萄糖注射液滅菌前后指紋圖譜相關性研究Δ

方洪壯，李睿，孫長海，李利，張宇（.佳木斯大學化學與藥學院，佳木斯市 54007；.黑龍江科倫制藥有限公司，慶安市 5400）

莪術油葡萄糖注射液滅菌前后指紋圖譜相關性研究Δ

方洪壯1＊，李睿1，孫長海1，李利2，張宇1（1.佳木斯大學化學與藥學院，佳木斯市 154007；2.黑龍江科倫制藥有限公司，慶安市 152400）

目的：研究滅菌前后的莪術油葡萄糖注射液指紋圖譜的相關性，為建立莪術油葡萄糖注射液指紋圖譜的檢測標準提供依據。方法：采用高效液相色譜法分離測定，色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測波長為210 nm。通過共有模式方法比較指紋圖譜的相關性；用成對比較t檢驗法比較單一色譜峰強度的變化。結果：莪術油葡萄糖注射液滅菌后較滅菌前多數色譜峰峰面積明顯變小，并增加了一些小峰。結論：莪術油葡萄糖注射液滅菌前后的指紋圖譜間均有較好的相關性。

莪術油葡萄糖注射液；指紋圖譜；相關性；高效液相色譜法

Δ黑龍江省教育廳科學技術研究項目（11521277）

＊教授。研究方向：藥物分析。電話：0454-8611265。E-mail：fhz-chjms@163.com

莪術油為溫莪術經水蒸氣蒸餾提取的揮發油[1]，含多種藥理活性成分。莪術油葡萄糖注射液為莪術油加葡萄糖和適當助溶劑制成的含藥輸液劑，作為抗病毒藥收載于2005年版《中國藥典》（二部）[2]。中藥注射劑指紋圖譜的相關性是中藥指紋圖譜研究的重要內容[3，4]，有多個品種注射劑、提取物、中間體和藥材之間相關性的研究報道[5～9]，但未見注射劑滅菌前后之間的指紋圖譜相關性研究。相關性的比較方法，現為整體上的共有模式間相似度計算和直觀分析及單一色譜峰的直觀比較。本試驗測定滅菌前后莪術油葡萄糖注射液的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜并比較它們之間的相關性；在單一色譜峰強度變化的比較上，引入了統計學檢驗方法，可克服單一色譜峰直觀比較的誤判。試驗結果可為控制莪術油葡萄糖注射液的質量和提升其質量標準提供數據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1100系列HPLC儀，包括G1379A脫氣機、G1311A四元泵、G1313A自動進樣儀、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測器（美國Agilent公司）；BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

10批溫莪術藥材由天瑞制藥有限公司提供，經佳木斯大學化學與藥學院宗希明高級實驗師鑒定為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，莪術油分別由各批溫莪術藥材粗粉加8倍量水，按《中國藥典》揮發油提取甲法提取5 h制得，注射液按相應制劑工藝要求制成，分作不經滅菌部分和滅菌部分；莪術二酮標準品（上海滬云醫藥開發有限公司，純度：99.6%）；莪術醇、吉馬酮、β-欖香烯對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為0080-20050521、10753-200212、00268-200401）；葡萄糖粉、依地酸二鈉、吐溫-80均為注射用，乙腈、甲醇為色譜純，磷酸、無水硫酸鈉為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 注射液供試液：分別取滅菌前后莪術油葡萄糖注射液直接作為注射液供試品溶液，分別記為供試液A和供試液B。

2.1.2 陰性溶液：取0.36 g吐溫-80，再加入5 mg依地酸二鈉，用5%葡萄糖溶液定容至100 mL容量瓶中，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為不含莪術油的陰性溶液。

2.1.3 對照品溶液：分別取莪術二酮、莪術醇、吉馬酮及β-欖香烯對照品適量，用甲醇制成4種對照品的混合溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm），Zorbax Eclipse XDB C18保護柱（12.5 mm×4.6 mm ID，5 μm）；柱溫：30℃；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（A相：0～5 min，55%；5～30 min，75%；30～45 min，90%；45～55 min，90%，55 min后，100%）；流速：1 mL·min-1；注射液與揮發油供試液的光譜-色譜圖顯示，210 nm波長處的信號強度、分離度、峰形與柱效均較為理想，60 min后無明顯色譜峰，故檢測波長確定為210 nm；色譜記錄時間為60 min。

2.3 成分的歸屬

取供試液A、對照品溶液和陰性溶液各20μL，分別進樣，色譜見圖1。

圖1 HPLC指紋圖譜A.供試品；B.對照品；C.陰性溶液；S1.莪術二酮；S2.莪術醇；S3.吉馬酮；S4.β-欖香烯Fig 1 HPLC fingerprintsA.test sample；B.reference substance；C.negative solution；S1.curdione；S2.curcumol；S3.germacrone；S4.β-elemene

由圖1可知，色譜中保留時間為13.5、18.8、25.5及51.6 min處的S1、S2、S3及S4色譜峰分別歸屬于莪術二酮、莪術醇、吉馬酮及β-欖香烯；注射液中的葡萄糖和其它輔料對莪術油葡萄糖注射液的色譜峰無干擾。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度：取同一供試液A，按上述色譜條件連續進樣5次，所得到的指紋圖譜與其中位值的相關系數分別為0.997 2、0.999 5、0.998 1、0.999 7和0.995 5，均＞0.99；相對應的RSD＝0.17%。各圖譜能夠很好地重合，表明儀器精密度較好。

2.4.2 穩定性：取同一供試液A，分別在0、4、8、12、18和24 h進樣。不同時間點測得的圖譜與其均值的相關系數分別為0.998 9、0.995 8、0.998 1、0.999 5、0.994 0 和 0.990 4，均＞0.99；相對應的RSD＝0.35%，表明樣品在24 h內較穩定。

2.5 指紋圖譜的建立

按“2.2”項下色譜條件測定10批滅菌前后的莪術油葡萄糖注射液，按全譜方式以中位數法分別建立共有模式（見圖2）。滅菌前后的注射液指紋圖譜均選取9個共有峰，分別占總峰面積的83.42%和66.64%，其中2、4、6、8號峰分別為莪術二酮、莪術醇、吉馬酮及β-欖香烯的特征峰。滅菌后10批樣品與其共有模式的相關系數分別為0.962 9、0.992 3、0.995 2、0.926 8、0.992 0、0.996 3、0.997 6、0.989 8、0.995 0和0.976 3，均＞0.92；滅菌前10批樣品與其共有模式的相關系數分別為0.960 2、0.987 5、0.996 4、0.890 7、0.989 6、0.994 3、0.996 2、0.989 0、0.998 5和0.984 6，均＞0.89。

2.6 指紋圖譜相關性分析

圖2 滅菌后與滅菌前注射液指紋圖譜的共有模式A.滅菌后；B.滅菌前Fig 2 Common fingerprints pattern of injection before and after sterilizationA.before sterilization；B.after sterilization

2.6.1 共有模式相關性：由圖2的指紋圖譜共有模式可見，注射液滅菌前后在HPLC指紋特征上相似。注射液滅菌后，色譜保留時間8 min前增加了一些小峰、出現了一些微量物質，部分特征峰的強度發生了一些變化。對滅菌前后的注射液指紋圖譜的共有模式進行相似度計算得到，滅菌前后間的相關系數為0.936 0。

2.6.2 共有峰比較：圖3為中位數共有模式下的共有峰面積柱型圖，共有峰分別以1～9標記。由圖3可見，莪術油注射液滅菌后的共有峰僅莪術醇（標記為4）峰面積變大，其余峰面積變小。共有峰面積統計學的成對比較t檢驗結果可知，各峰的檢驗計算值分別為7.99、27.0、11.1、12.0、9.19、18.9、8.88、8.76及15.2，均＞檢驗的臨界值3.25（P＝0.01），表明滅菌前后共有峰面積間有高度顯著差異。

圖3 共有峰面積柱型圖A.滅菌注射液；B.未滅菌注射液Fig 3 Columnar diagram of common peak areaA.sterilized injection；B.non-sterilized injection

3 討論

3.1 共有峰的選擇

莪術油葡萄糖注射液指紋圖譜中，多數峰的強度較小，本試驗選用峰面積最大的吉馬酮為參照物，以超過其峰面積5%、保留時間和峰面積均比較穩定的色譜峰為共有峰。

3.2 相似性比較

中藥的藥材、提取物及制劑的色譜指紋圖譜間單一共有峰相似性的比較，僅見直觀比較，有時難以給出確切的判定。如滅菌前后的1號峰在直觀上較接近，但統計學檢驗有顯著差異，可見統計學方法可克服對峰強度變化的直觀誤判。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：279.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：592.

[3]王 旭，王國榮.中藥注射劑指紋圖譜研究的現狀和分析[J].中國藥品標準，2005，6（4）：48.

[4]楊東風，梁宗鎖.中藥指紋圖譜研究進展[J].中國藥房，2008，19（6）：467.

[5]饒春愷，羅順德，雷嘉川，等.當歸注射液指紋圖譜初步研究[J].中成藥，2003，26（10）：775.

[6]游 松，王 亮，蔣雅紅，等.銀杏葉注射劑指紋圖譜的研究[J].中草藥，2002，33（3）：216.

[7]蘭燕宇，劉麗娜，王永林，等.注射用復方葒草（凍干粉針）指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志，2005，30（6）：440.

[8]羅遠秀，文東旭，蔣受軍，等.巖黃注射液與藥材及提取物間指紋圖譜相關性研究[J].藥物分析雜志，2007，27（7）：1 014.

[9]唐旭利，劉 靜，李國強，等.注射用丹紅（粉針）-中間體-藥材HPLC指紋圖譜相關性研究[J].中國海洋大學學報，2009，39（1）：61.

Study on Fingerprints Correlation of Zedoary Turmeric Oil and Glucose Injection before and after Sterilization

FANG Hong-zhuang，LI Rui，SUN Chang-hai，ZHANG Yu（College of Chemistry and Pharmacy，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China）
LI Li（Heilongjiang Kelun Pharmaceutical Co.，Ltd.，Qing’an 152400，China）

OBJECTIVE：To study fingerprints correlation of Zedoary turmeric oil and glucose injection before and after sterilization，and to provide reference for the establishment of detecting standard of fingerprints of Zedoary turmeric oil and glucose injection.METHODS：HPLC method was used.The separation was performed on Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm）column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid water（gradient elution）at flow rate of 1 mL·min-1.The column temperature was set at 30℃and detection wavelength was 210 nm.The fingerprints correlation was compared by the method of common pattern.The change of the unity chromatographic peak was analyzed by pairedt-test.RESULTS：After sterilization，the chromatographic peak areas of the injection were obviously diminished and some tiny chromatographic peaks appeared.CONCLUSION：There is a good relationship between the fingerprints of Zedoary turmeric oil and glucose injection before and after sterilization.

Zedoary turmeric oil and glucose injection；Fingerprints；Correlation；HPLC

R283.61；R927.2

A

1001-0408（2010）39-3702-03

2009-11-01

2010-04-09）