葛根總黃酮的HPCE指紋圖譜研究Δ

陳樹和，陳荔，巴 賽，劉焱文（1.湖北省中醫院，武漢市 40061；.湖北中醫藥大學中藥資源與中藥復方省部共建教育部重點實驗室，武漢市 40061；.廣東藥學院，廣州市 510006）

葛根總黃酮的HPCE指紋圖譜研究Δ

陳樹和1＊，陳荔2，巴 賽3，劉焱文（21.湖北省中醫院，武漢市 430061；2.湖北中醫藥大學中藥資源與中藥復方省部共建教育部重點實驗室，武漢市 430061；3.廣東藥學院，廣州市 510006）

目的：建立葛根總黃酮的高效毛細管電泳（HPCE）指紋圖譜。方法：運行緩沖液為30 mmol·L-1硼砂溶液，分離電壓為13 kV，進樣時間為5 s，檢測波長為254 nm，柱溫為25℃。結果：從葛根總黃酮HPCE指紋圖譜中標定了14個共有峰，其總峰面積達到93%以上。結論：所建立的指紋圖譜準確、可靠，可用于評價和控制葛根總黃酮的質量。

葛根；總黃酮；高效毛細管電泳法；指紋圖譜

葛根始載于《神農本草經》，為豆科植物葛根Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，習稱野葛，具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉之功效[1]。葛根主要含葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類化合物[2]。現代藥理研究表明，葛根黃酮和葛根素具有調節血壓、擴張冠脈血管、抗心律失常和抗心肌缺血等作用[2]，臨床主要用于治療高血壓、心律失常、心肌梗死等病癥。本文采用大孔吸附樹脂純化工藝提取分離葛根總黃酮，并采取高效毛細管電泳（HPCE）法建立了葛根總黃酮的指紋圖譜，旨在為葛根藥材質量的評價和控制提供依據。

Δ武漢市科學技術計劃項目（2002600513406）

＊主任藥師，碩士研究生導師。研究方向：中藥及其制劑有效成分。電話：027-88929176。E-mail：chenshuhe606@163.com

1 儀器與材料

1.1 儀器

P/Asystem 5000型毛細管電泳儀（美國Beckman公司）。

1.2 試藥

葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-200209）；D101型大孔樹脂（天津市海光化工有限公司）；甲醇為色譜純，水為高純水，其它試劑均為分析純；葛根藥材經湖北中醫學院中藥鑒定教研室鑒定為豆科植物葛根P.lobata（Willd.）Ohwi的干燥根。

2 方法與結果

2.1 葛根總黃酮的制備

取葛根藥材，加入70%乙醇回流提取3次，提取液回收乙醇至盡，過D101大孔吸附樹脂柱，用水洗至近無色，再用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇并濃縮至適量，干燥，即得葛根總黃酮提取物

[3]

。經紫外-可見分光光度法測定

[4]

，提取物中總黃酮的含量達50%以上。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取葛根素對照品適量，精密稱定，用甲醇制成50 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取10個不同產地葛根藥材粗粉，每份10 g，精密稱定，照“2.1”項下方法提取分離葛根總黃酮，用70%乙醇制成0.2 g（生藥）·mL-1的溶液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 色譜條件 色譜柱：融熔石英毛細管（75μm×57 cm）；運行緩沖液：30 mmol·L-1硼砂溶液；操作電壓：13 kV，極性由正到負；紫外檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；采用壓力進樣，進樣時間：5 s。

毛細管沖洗方法：開機后用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液沖洗2 min，水沖洗2 min，再運行緩沖液沖洗3 min，每2次進樣測定之間運行緩沖液沖洗2 min。

2.3.2 對照試驗 取葛根素對照品溶液，按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖，詳見圖1A。

2.3.3 精密度試驗 取同一供試品溶液（1號樣品），連續進樣5次，測得各共有峰相對保留時間的RSD＜2.0%，相對峰面積的RSD＜5.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液（1號樣品），分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，測得各共有峰相對峰面積的RSD＜5.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.5 重復性試驗 取葛根1號樣品6份，每份10 g，精密稱定，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，測得各共有峰相對峰面積的RSD＜5.0%，表明方法重復性較好。

2.4 指紋圖譜的建立及各項技術參數測定

2.4.1 指紋圖譜的制備 取上述10個不同產地葛根樣品，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件進行分析，考察40 min內供試品溶液的分離情況，記錄32 min內電泳圖，詳見圖1B。

2.4.2 共有指紋峰的確認 比較10個不同產地葛根藥材樣品的HPCE圖譜，以相對保留時間標定分離度較好和相對峰面積較大的14個共有指紋峰，生成標準指紋圖譜，并指認9號峰為葛根中主要有效成分葛根素的峰，詳見圖2。

2.4.3 共有峰的相對保留時間、峰面積、相對峰面積 9號峰（葛根素）峰面積占總峰面積的40%，以其作為參照峰（S），計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積（見表1、表2），其RSD＜5.0%。共有峰總峰面積占總峰面積的平均百分比為96.22%，RSD＝1.35%，符合指紋圖譜的有關規定（見表3）。

圖1 HPCE圖譜A.葛根素對照品；B.供試品Fig 1 HPCE chromatogramsA.puerarin control；B.test sample

圖2 葛根總黃酮的HPCE指紋圖譜Fig 2 HPCE fingerprints of total flavonoids from P.lobata

表1 10批樣品共有峰相對保留時間Tab 1 Relative retention times of common peaks for 10 batches of samples

表2 10批樣品共有峰相對峰面積Tab 2 Relative areas of common peaks for 10 batches of samples

表3 10批樣品來源及共有峰峰面積Tab 3 The origin and areas of common peaks for 10 batches of samples

3 討論

2005年版《中國藥典》（一部）葛根項下，主要采用以高效液相色譜（HPLC）法測定葛根素含量來控制其質量，具有一定的局限性。指紋圖譜可以提供中藥及天然藥物中多個化學成分的信息，已成為國際公認的控制中藥和天然藥物質量的最有效的手段。目前，葛根藥材指紋圖譜的研究主要采用HPLC法[5，6]，本文選取10個不同產地葛根藥材樣品，采用HPCE法建立了葛根總黃酮的指紋圖譜，標定了14個共有峰，其總峰面積達到93%以上，可以用來評價和控制葛根藥材及其總黃酮的質量。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：233.

[3]向大雄，李煥德，吳大勇，等.不同純化工藝對葛根總黃酮質量的影響[J].中國藥房，2002，13（6）：328.

[4]鐘 可，何建億.葛根不同炮制品中總黃酮的含量測定[J].貴陽中醫學院學報，2004，26（4）：59.

[5]楊榮平，王賓豪，壽清耀.葛根藥材HPLC指紋圖譜研究[J].重慶中草藥研究，2006，1：14.

[6]石 峰，司成桃，陳 衛.葛根藥材及其提取物HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥學雜志，2006，41（11）：820.

Study on HPCE Fingerprints of Total Flavonoids fromPueraria lobata

CHEN Shu-he（Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430061，China）
CHEN Li-da，LIU Yan-wen（Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Resource and Compound Prescription，Ministry of Education，Hubei University of TCM，Wuhan 430061，China）
BA Sai（Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To establish the HPCE fingerprints of total flavonoids fromPueraria lobata.METHODS：HPCE method was used with 30 mmol·L-1borax as buffer.Separation voltage was 13 kV and sampling time was 5 second.The detection wavelength was set at 254 nm，and the column temperature was maintained at 25℃.RESULTS：14 common peaks of total flavonoids fromP.lobatawere successfully separated，and total areas of common peaks were above 93%.CONCLUSION：Established HPCE fingerprint of total flavonoids fromP.lobatais accurate and reliable.It can be used for the quality evaluation and control of total flavonoids fromP.lobata.

Pueraria lobata；Total flavonoids；HPCE；Fingerprints

R284.1；R927.1

A

1001-0408（2010）39-3709-03

2009-11-12

2010-06-12）