雙向發酵對川烏指紋圖譜及烏頭堿類成分含量的影響Δ

王身艷，潘揚，蔣亞平，唐海霞，陳建偉（南京中醫藥大學，南京市 210029）

雙向發酵對川烏指紋圖譜及烏頭堿類成分含量的影響Δ

王身艷＊，潘揚，蔣亞平，唐海霞，陳建偉#（南京中醫藥大學，南京市 210029）

目的：觀察川烏被19種藥用真菌發酵后，烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量的變化及高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的差異。方法：將川烏作為“藥性基質”，在一定的條件控制下，應用雙向發酵技術，使其被槐耳、靈芝、紅栓等19種藥用真菌發酵，產生藥材的“藥性菌質”，并采用反相高效液相色譜法對“藥性菌質”和生藥材中所含的烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿進行含量測定，比較其含量的變化及指紋圖譜的差異。結果：在一定的時間范圍內，大多數的菌株在川烏基質上的適應性良好，菌絲體生長旺盛，如代號A、C、D、E、F、M、Q、V、SW、い等真菌。發酵之后的川烏中烏頭堿、新烏頭堿及次烏頭堿含量與生藥材比較多數有明顯的降低。結論：雙向發酵后多數“藥性菌質”中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿含量明顯降低了，提示雙向發酵是生物技術在中醫藥領域中應用的有益嘗試。

川烏；烏頭堿；新烏頭堿；次烏頭堿；生物轉化；反相高效液相色譜法

Δ南京中醫藥大學科技項目（09XZR18）

＊講師，博士研究生。研究方向：有毒中藥的生物轉化。E-mail：wsy741120@yahoo.com.cn

#通訊作者：教授。研究方向：中藥資源學。電話：025-85811659

雙向固體發酵是南京中醫藥大學藥用菌與中藥生物技術研究中心莊毅教授于20世紀80年代創立的一種新型中藥發酵技術，它用具有活性成分的中藥作為藥性基質，被藥用真菌發酵，產生一系列復雜的生理活動和生化效應，從而產生新的活性成分和新的功能，無需將藥用真菌與次級代謝產物分離，二者共同使用，協同發揮藥效[1]。中藥發酵的目的主要是為了增強藥效、發現新的治療作用、減毒解毒、擴大用藥品種等。如潘揚等[2]采用藥用真菌對馬錢子進行雙向發酵，結果表明，與空白對照比較，士的寧、馬錢子堿的含量均呈下降趨勢，而士的寧氮氧化物、馬錢子堿氮氧化物有不同程度的增加。

川烏為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.的干燥母根，在臨床已有幾千年的應用歷史，具祛風除濕、溫中止痛之功效。烏頭類藥材中含烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿等雙酯型生物堿。這些雙酯型生物堿既是毒性成分，也是活性成分，但性質不穩定，遇水加熱容易水解成毒性較小的苯甲酰單酯型生物堿及親水性氨基醇類烏頭原堿。目前，烏頭的炮制方法過分強調解毒，而忽視烏頭的功效特點。本試驗通過雙向固體發酵技術對烏頭類中藥進行生物轉化研究，以期達到去毒存（增）效的目的。此項研究內容國內、外尚未見報道。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-10AT型高效液相色譜（HPLC）系統，包括LC-10ATAB雙泵、SPD-10A紫外檢測器、ERC-3415自動脫氣機、AT-5300OVEN柱溫箱（日本島津公司）；AE240型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器（江蘇金壇國勝儀器廠）；國華數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；抽濾泵（瑞士Buchi公司）。

1.2 試劑

乙腈為色譜純（美國Tedia公司），水為雙蒸水，其它試劑均為分析純（南京化學試劑有限公司）。

1.3 對照品

烏頭堿（批號：110720-200410）、新烏頭堿（批號：0799-9403）、次烏頭堿（批號：0798-9403）對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.4 樣品

運用“雙向發酵”技術，通過槐耳、靈芝、紅栓等真菌的生物轉化過程，發酵后從“藥性基質”中獲得19個川烏的“藥性菌質”樣品，另有1個為空白對照（未經發酵）樣品。

1.5 真菌菌株的選擇

根據以往“雙向固體發酵”的經驗，首選槐耳、靈芝等19種經過菌株鑒定的藥用真菌（南京中醫藥大學藥用菌與中藥生物技術研究所保藏）作為在川烏“藥性基質”上進行生長條件篩選試驗的菌株。

1.6“藥性基質”的來源

川烏購自南京市藥材公司，經南京中醫藥大學藥學院陳建偉教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭A.carmichaeliDebx.的干燥母根。

1.7 川烏“藥性菌質”的培養

在一定的生物技術控制下，使川烏“藥性基質”被槐耳、靈芝、紅栓等真菌發酵。根據真菌與基質組合的發酵情況，即菌株能否與“藥性基質”相適應而正常生長為指標，在菌絲體生長一段時間后，取出各真菌發酵后的“藥性菌質”，低溫干燥，即得。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取烏頭堿1.4 mg、新烏頭堿3.1 mg、次烏頭堿3.9 mg，用0.05%的鹽酸甲醇溶液定容至5 mL，放置冰箱貯藏，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取川烏樣品粉末1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞燒瓶中，加入適量氨試液潤濕，再加入20 mL乙醚，靜置24 h，超聲提取30 min，濾過，40℃水浴揮干，滴加鹽酸-甲醇試液，定容至2 mL，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Hanborn Sci&Tech Bentnach-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-40 mmol·L-1乙酸銨（氨水調pH 9.5），梯度洗脫（0→10 min，A的體積百分數為12%→20%；10→50 min，A為20%→52%；50→80 min，A為52%→60%）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：240 nm；進樣量：20 μL。

2.1.4 樣品含量的測定及烏頭堿類化合物指紋圖譜的建立

取不同真菌發酵的川烏“藥性菌質”，按上述色譜條件與方法，測定樣品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的含量變化和川烏指紋圖譜的差異。

2.2 結果

2.2.1 菌絲體生長情況及烏頭堿類的含量測定結果 在同一發酵條件下，槐耳、靈芝等19種真菌對以川烏生品為“藥性基質”的發酵情況有所不同。根據真菌與基質組合雙方的發酵情況，初步判定代號為A、B、C、D、E、F、H、L、M、N等19種菌株與藥材“藥性基質”基本相適應，菌絲體能夠正常生長發育。

川烏菌質得率情況：菌絲體生長的好壞與發酵后“藥性菌質”相對得率（%）呈負相關，即菌絲體生長較好者，菌質相對得率低；生長較差者，菌質相對得率高。菌質得率（%）＝藥性菌質干重（g）/藥性基質干重（g）×100%。

川烏菌質得率見表1。

2.2.2 川烏的指紋圖譜 利用HPLC的高分離能力，采集雙向發酵后川烏藥材中復雜的化學成分信息，建立其菌質的生物堿類成分的指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

從圖1、圖2可以看出，與發酵空白對照比較，H、V、O①等真菌作用于川烏后，指紋圖譜中顯示出有不同的新產生的或含量變化較大的未知成分；與市售制川烏比較，指紋圖譜中顯示出相同的成分，但含量明顯高于市售制川烏。

3 討論

表1 川烏菌質得率Tab 1 The yield of mycoplasma ofA.carmichaeli

圖1 川烏的HPLC指效圖譜A.混合對照品；B.川烏生藥材；C.川烏發酵空白對照；D.市售制川烏；E.川烏+V發酵品；F.川烏+H發酵品；1.新烏頭堿；2.烏頭堿；3.次烏頭堿Fig 1 HPLC chromatograms ofA.carmichaeliA.mixed substance；B.A.carmichaeli；C.fermented A.carmichaeli control；D.A.carmichaeli for sale；E.A.carmichaeli+fermented V；F.A.carmichaeli+fermented H；1.aconitine；2.mesaconine；3.hypaconitine

本試驗用川烏藥材作為“藥性基質”，由選定的藥用真菌發酵，產生一系列復雜的生理活動和生化效應，產生新的活性成分和新的功能。一方面藥用真菌在生長過程中會產生各種各樣的生物活性物質；另一方面進行生命活動所產生的豐富而強大的酶系則是中藥發生化學反應的物質基礎?，F代發酵工程證實，微生物具有水解、酯化、氧化、乙酰化、甲基化、羥基化和羰基化等多種能力，有可能將烏頭類中藥中的毒性成分雙酯型生物堿分解為單酯型或醇胺型或未知類型生物堿，達到降低毒性的目的；也可能將烏頭中的成分轉化形成新的成分，或者烏頭中的成分與藥用真菌的次生代謝產物發生復方、協同作用，形成新的化合物。

圖2 HPLC圖譜比較A.川烏發酵空白對照；B.川烏+O①發酵品Fig 2 Comparison of HPLC chromatogramsA.fermentedA.carmichaeli control；B.A.carmichaeli+femented O①

由上述圖譜的對比可以看出，通過真菌的發酵分解，烏頭堿類的含量在菌株的轉化作用下明顯降低，說明烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿均在真菌的作用下參與了生物轉化。而且一些真菌在發酵后，與市售制川烏比較，指紋圖譜中顯示出相同的成分，但含量明顯高于市售制川烏。其藥效和毒理實驗正在進行中。

藥用真菌進行生物轉化較其他方法有以下優點：反應選擇性強、反應條件溫和、能耗少、操作簡單、低毒、低殘留、不造成環境污染和后處理簡單等。其可能完成化學方法難以進行或不能進行的化學反應，得到結構更合理或活性更強的先導化合物。因此，本項研究不僅可為烏頭炮制提供新工藝，對其具毒性且有效的成分含量進行測定和研究，為科學地闡明雙向固體發酵機制奠定基礎，也可保證中藥臨床使用的安全和有效。

[1]莊 毅.藥用真菌新型（雙向性）固體發酵工程[J].中國食用菌，2002，21（4）：3.

[2]潘 揚，張 弦，蔣亞平，等.雙向發酵前后馬錢子生物堿含量及其HPLC指紋譜的比較[J].南京中醫藥大學學報，2006，22（6）：362.

Effects of Two-way Fermentation on the Fingerprints ofAconitum carmichaeliand the Content of Aconitine

WANG Shen-yan，PAN Yang，JIANG Ya-ping，TANG Hai-xia，CHEN Jian-wei（Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China）

OBJECTIVE：To observe the contents of aconitine，mesaconine and hypaconitine and the difference of HPLC fingerprints ofAconitum carmichaeliafter fermented with 19 kinds of medicine fungus.METHODS：Under the control of certain experiment conditions，A.carmichaeliwas used as ground substance and fermented by two-way fermentation with 19 kinds of medicine fungus，such asTrametes robiniophila，Ganoderma lucidum，Pycnoporus cinnabarius.The product of medicinal ground substance mixed with mycelia was called“medicinal mycoplasma”.An RP-HPLC method was then established to determine the contents of aconitine，mesaconine and hypaconitine.The difference of the content and HPLC fingerprints were compared.RESULTS：At different zymolytic times，most of their mycelia grew normally and quickly，especially number A，C，D，E，F，M，Q，V，SW，いand so on.The contents of aconitine，mesaconine and hypaconitine in fermentedA.carmichaeliwere significantly lower than inA.carmichaeli.CONCLUSION：The contents of aconitine，mesaconine and hypaconitine in“medicinal mycoplasma”have been decreased significantly.Two-way fermentation is conducive exploration of biotechnology in the filed of traditional Chinese medicine.

Aconitum carmichaeli；Aconitine；Mesaconine；Hypaconitine；Biotransformation；RP-HLPC

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2010）39-3712-03

2010-01-28

2010-05-05）