表面活性劑對(duì)兩性霉素B溶解行為的影響Δ

劉 宏，余再軍，劉 明，張 宜（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科，武漢市 430070）

兩性霉素B（Amphotericin B，AMB）屬多烯類(lèi)抗真菌藥，其通過(guò)與真菌細(xì)胞膜上的麥角固醇結(jié)合，影響細(xì)胞膜通透性而發(fā)揮抑制真菌生長(zhǎng)的作用。雖然兩性霉素B有明顯的肝、腎毒性，但因其在治療嚴(yán)重的深部真菌引起的內(nèi)臟或全身感染中有確切的療效，仍然為臨床廣泛使用[1]。由于兩性霉素B在大多數(shù)的溶劑中的溶解性較差，不溶于水、無(wú)水乙醇，微溶于二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇，僅溶于二甲基亞砜（DMSO），這種性質(zhì)限制了其新劑型的研究，致使臨床使用的劑型較為單一。筆者在本文中通過(guò)對(duì)9種非離子、陽(yáng)離子、陰離子及兩性離子表面活性劑對(duì)兩性霉素B溶解行為的影響考察，希望篩選出對(duì)兩性霉素B具有良好增溶效果的增溶劑，以期為研究劑量更小、療效更高的兩性霉素B新劑型提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試藥

兩性霉素B（華北制藥華勝有限公司，批號(hào)：HAN0506301，純度：99.5%）；卵磷脂（Lecithin，上海伯奧生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20020404）；吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、司盤(pán)-20（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；泊洛沙姆188（南京威爾化工有限公司）；脫氧膽酸鈉（寧波科瑞生物工程公司）；十二烷基磺酸鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）；十六烷基三甲基氯化銨（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；其余試劑、輔料均為分析純。

1.2 儀器

KT-300Y超聲波藥品處理機(jī)（濟(jì)寧中冠超聲波有限責(zé)任公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；UV-2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；SHZ-82水平振蕩機(jī)（金壇城西天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.3 兩性霉素B濃度測(cè)定方法學(xué)考察

精密稱(chēng)取25 mg兩性霉素B置于100 mL容量瓶中，加二甲基亞砜至刻度，移取20 mL至100 mL容量瓶中，加二甲基亞砜至刻度，搖勻，即配得溶液濃度為50 μg·mL－1。精密稱(chēng)取此溶液 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL 置于 10 mL 容量瓶中，加DMSO至刻度，搖勻。分別在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度[2]，以質(zhì)量濃度（X）和吸光度（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝0.044 6X+0.008 3（r＝0.999 7），兩性霉素B檢測(cè)濃度線性范圍為5～50 μg·mL－1。日內(nèi)和日間精密度分別為3.16%和3.72%（n＝5），平均回收率為98.81%。

1.4 表面活性劑對(duì)兩性霉素B溶解行為的影響考察

選用的表面活性劑分別為非離子型司盤(pán)-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、泊洛沙姆188，陰離子型十二烷基磺酸鈉、脫氧膽酸鈉，陽(yáng)離子型十六烷基三甲基氯化銨及兩性離子型卵磷脂。準(zhǔn)確稱(chēng)取2.000 g各表面活性劑，移入500 mL的容量瓶中，搖勻、配制成4.0 mg·mL－1的母液，再用移液管準(zhǔn)確量取2.5、5、10、20、25 mL母液，分別移入50 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻即得濃度為0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、4.0 mg·mL－1的表面活性劑溶液。用移液管取上述配制的各溶液2 mL移至10 mL容量瓶中，加純化水至刻度。剩余溶液供調(diào)節(jié)空白使用。將10 mL容量瓶中各濃度的表面活性劑溶液移入塑料試管（10 mL）中，用毛細(xì)管分別加入適量的兩性霉素B，于超聲波藥品處理機(jī)中超聲2 h，超聲完畢后于震蕩機(jī)中震蕩24 h，震蕩機(jī)的轉(zhuǎn)速為60轉(zhuǎn)·min－1，以促進(jìn)兩性霉素B的溶解。待振蕩完畢后取出，靜置，25℃過(guò)濾，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濾液吸光度。從吸光度結(jié)果計(jì)算濃度及最大增溶百分比，最大增溶百分比（%）＝（加入表面活性劑時(shí)的最大溶解量－未加入表面活性劑時(shí)的溶解量）/未加入表面活性劑時(shí)的溶解量×100%。兩性霉素B未加入表面活性劑時(shí)在25℃水中的溶解量是2.98 μg·mL－1。

2 結(jié)果

2.1 非離子型表面活性劑對(duì)兩性霉素B溶解行為的影響

加入不同濃度司盤(pán)-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、泊洛沙姆188時(shí)兩性霉素B的溶解度曲線見(jiàn)圖1。

圖1 非離子型表面活性劑對(duì)兩性霉素B溶解行為的影響Fig 1 Solubilization effect of non-ionic surfactant on amphotericin B

由圖1可見(jiàn)，在所選用的5種非離子表面活性劑中，吐溫-40對(duì)兩性霉素B的溶解行為的改善有限，最大增溶百分比為353.46%（0.8 m·mL－1），而其余4種均顯示出較好的增溶作用，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。各表面活性劑在所考察的濃度范圍內(nèi)最大增溶百分比司盤(pán)-20為1 365.44%（4 mg·mL－1）、吐溫-60為 1 165.30%（4 mg·mL－1）、吐溫-80為973.46%（0.4 mg·mL－1）、泊洛沙姆188為 1 527.95%（4 mg·mL－1）。總體的增溶效果以泊洛沙姆188為最佳，其在4 mg·mL－1濃度時(shí)對(duì)兩性霉素B的增溶效果最高達(dá)15.3倍，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

2.2 陰離子型表面活性劑對(duì)兩性霉素B溶解行為的影響

加入不同濃度十二烷基苯磺酸鈉、脫氧膽酸鈉時(shí)兩性霉素B的溶解度曲線見(jiàn)圖2。

圖2 陰離子型表面活性劑對(duì)兩性霉素B溶解行為的影響Fig 2 Solubilization effect of anionic surfaceactive agent on amphotericin B

由圖2可見(jiàn)，陰離子表面活性劑脫氧膽酸鈉在本試驗(yàn)條件中對(duì)兩性霉素B溶解行為的影響有限，最大增溶百分比為88.62%（4 mg·mL－1）；而十二烷基磺酸鈉在4 mg·mL－1濃度時(shí)具有較明顯的增溶作用，最大增溶百分比可達(dá)到1 199.16%，增溶效果最高達(dá)12倍，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

2.3 陽(yáng)離子型表面活性劑對(duì)兩性霉素B溶解行為的影響

加入不同濃度十六烷基三甲基氯化銨時(shí)兩性霉素B的溶解度曲線見(jiàn)圖3。

圖3 陽(yáng)離子型表面活性劑對(duì)兩性霉素B溶解行為的影響Fig 3 Solubilization effect of cationic surfaceactive agent on amphotericin B

由圖3可見(jiàn)，陽(yáng)離子型表面活性劑十六烷基三甲基氯化銨在0.2～4 mg·mL－1濃度內(nèi)對(duì)兩性霉素B具有較明顯的增溶作用，最大增溶百分比可達(dá)到1 671.68%（4 mg·mL－1），增溶效果最高達(dá)16.7倍，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

2.4 兩性離子型表面活性劑對(duì)兩性霉素B溶解行為的影響

加入不同濃度卵磷脂時(shí)兩性霉素B的溶解度曲線見(jiàn)圖4。

圖4 兩性離子型表面活性劑對(duì)兩性霉素B溶解行為的影響Fig 4 Solubilization effect of lecithin as bi-ionactiveagent on amphotericin B

由圖4可見(jiàn)，兩性離子型表面活性劑卵磷脂在濃度0.2～4 mg·mL－1濃度范圍內(nèi)對(duì)兩性霉素B的溶解行為的改善有限，最大增溶百分比為314.36%（4 mg·mL－1）。

從以上試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，以最大增溶百分比為指標(biāo)，各表面活性劑的增溶作用依次為十六烷基三甲基氯化銨＞泊洛沙姆188＞司盤(pán)-20＞十二烷基磺酸鈉＞吐溫-60＞吐溫-80＞吐溫-40＞卵磷脂＞脫氧膽酸鈉。

3 討論

藥物的難溶性是影響制劑研發(fā)的常見(jiàn)問(wèn)題，增加難溶性藥物溶解度也是改善藥物的吸收和提高生物利用度的有效途徑之一[3]。兩性霉素B分子結(jié)構(gòu)中雖然含有羧基、氨基及多個(gè)羥基，但其幾乎不溶于水，較差的水溶性成為其應(yīng)用的主要障礙之一。通過(guò)制備成脂質(zhì)體[4]或微乳[5]等方式可改善其溶解性，但畢竟二者屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系；而通過(guò)增溶的方法所獲得的增溶體系為熱力學(xué)穩(wěn)定體系，所以通過(guò)增溶的方法提高兩性霉素B的溶解性對(duì)于研發(fā)新的兩性霉素B制劑具有積極的意義。從本試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，多數(shù)具有較大親水親油平衡（HLB）值的表面活性劑如吐溫-60（HLB值14.9）、吐溫-80（HLB值15）、司盤(pán)-20（HLB值8.6）、泊洛沙姆188（HLB值29）、十二烷基磺酸鈉（HLB值10.6）、脫氧膽酸鈉（HLB值16）及十六烷基三甲基氯化銨（HLB值15.8）等在以水為溶劑的體系中對(duì)兩性霉素B的溶解行為具有明顯改善作用。而HLB值相對(duì)較低的如兩性離子表面活性劑卵磷脂（HLB值7）單獨(dú)使用時(shí)則在以水為溶劑的體系中對(duì)兩性霉素B的溶解行為無(wú)明顯影響。

非離子表面活性劑（特別是含聚氧乙烯鏈的非離子表面活性劑）極性基形成的膠團(tuán)外殼（柵欄層）占據(jù)膠團(tuán)相當(dāng)大部分的體積，親水性聚氧乙烯及其所締合的水分子使得這種膠團(tuán)的外層體積更為龐大，并且聚氧乙烯鏈以螺旋狀伸向水相中，這可以使得兩性霉素B分子中疏水部分被取向于內(nèi)核部分，而含有羥基、羧基等的極性部分則被取向于膠團(tuán)的柵欄層，從而使兩性霉素B在以水為溶解介質(zhì)的體系中的溶解度顯著提高。同時(shí)，由于非離子表面活性劑由于其在溶液中呈不解離狀態(tài)，如本試驗(yàn)中的吐溫-60、吐溫-80、司盤(pán)-20及泊洛沙姆188等，所以不易受電解質(zhì)和溶液的影響，與離子型表面活性劑相比具有更好的穩(wěn)定性和相溶性，毒性和溶血性也更小，且能與大多數(shù)藥物配伍等。這就提示，在兩性霉素B新制劑的研發(fā)中可以考慮使用上述非離子表面活性劑作為增溶劑以改善兩性霉素B的溶解行為。

本試驗(yàn)所選用的陽(yáng)離子型表面活性劑十六烷基三甲基氯化銨和陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉顯示出良好的增溶作用，可以在外用制劑研發(fā)時(shí)作為增溶劑使用。但因?yàn)殡x子型的表面活性劑在水中可以電離，加入無(wú)機(jī)鹽會(huì)使膠束中的柵欄層分子間的電斥力減小，分子排列更加緊密，因而減少被增溶物存在的空間，導(dǎo)致增溶能力降低，所以在處方中注意避免使用電解質(zhì)，以保持體系的穩(wěn)定。而在本試驗(yàn)中，在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，單獨(dú)使用脫氧膽酸鈉對(duì)兩性霉素B的溶解行為無(wú)明顯改善。

[1]Kleinberg M.What is the current and future status of conventional amphotericin B?[J].Int J Antimicrob Agents，2006，27（Suppl）：12.

[2]文 曄，劉 宏，湯 韌，等.兩性霉素B磁性脂質(zhì)體的制備與質(zhì)量控制[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27（10）：1 344.

[3]施潔明，何仲貴.表面活性劑在新劑型中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥房，2003，14（3）：179.

[4]Esposito E，Bortolotti F，Menegatti E，et al.Amphiphilic association systems for amphotericin B delivery[J].Int J Pharm，2003，260（2）：249.

[5]Veerareddy PR，Vobalaboina V.Lipid-based formulations of amphotericin B[J].Drugs Today，2004，40（2）：133.