殼聚糖處理對馬鈴薯塊莖組織活性氧代謝的影響

李永才，孫小娟，2，畢 陽，*

(1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070;2.天祝藏族自治縣農技中心，甘肅天祝733200)

殼聚糖處理對馬鈴薯塊莖組織活性氧代謝的影響

李永才1，孫小娟1，2，畢 陽1，*

(1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070;2.天祝藏族自治縣農技中心，甘肅天祝733200)

以大西洋馬鈴薯(cv.Atlantic)塊莖為試材，研究了殼聚糖處理及干腐病菌Fusarium sulphureum挑戰(zhàn)接種對馬鈴薯塊莖組織活性氧(ROS)代謝的影響，結果表明:殼聚糖處理能顯著提高馬鈴薯切片過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子()和抗壞血酸(AsA)含量及過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性，而降低超氧化物歧化酶(SOD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性，F(xiàn).sulphureum挑戰(zhàn)接種可進一步提高殼聚糖處理及對照馬鈴薯切片的H2O2和O2－的含量及CAT、APX和GR的活性。可見殼聚糖和病原物可通過誘導氧迸發(fā)而啟動馬鈴薯組織的抗病反應。

殼聚糖，活性氧代謝，馬鈴薯塊莖，硫色鐮刀菌，干腐病

Abstract:Effect of chitosan treatment and Fusarium sulphureum change inoculation on reactive oxygen species metabolism in potato tuber slices was studied.The results showed that chitosan significantly increased the contents of hydrogen peroxide(H2O2)，super oxide radical(O2)and ascorbic acid(AsA)and activities of catalase(CAT)and glutathion reductase(GR)，however activities of superoxide dismutase(SOD)and ascorbic peroxidase(APX)were decreased.The activities of CAT，APX and GR and the production of H2O2and O－2were enhanced furthermore by inoculated with F.sulphureum in the treated tissue and the control.It was proposed that chitosan as a chemical activator could induce oxidative burst and then initiate disease defence response of potato tuber tissue.

Key words:chitosan;reactive oxygen species metabolism;potato tuber;Fusarium sulphureum;dry rot

馬鈴薯塊莖干腐病是馬鈴薯貯藏期間的主要病害，早期估計其造成的損失每年平均達6%～10%，有時甚至高達60%［1］。近年來對甘肅省馬鈴薯主產區(qū)馬鈴薯貯藏期病害調查發(fā)現(xiàn)平均病薯率為27.59%，其中88.5%為硫色鐮刀菌(Fusarium sulphureum)引起的黑色干腐型病薯，給馬鈴薯的鮮食和加工帶來很大的經濟損失［2］。但目前主要是通過采后使用噻苯咪唑等化學合成殺菌劑進行控制，然而由于病原物對噻苯咪唑抗藥性、農藥殘留和環(huán)境污染問題受到普遍關注，因此尋求一種替代方法來控制該病已勢在必行。殼聚糖作為一種天然的防腐保鮮劑，本實驗室近期研究表明，殼聚糖不但能有效地抑制馬鈴薯干腐病菌的生長、孢子萌發(fā)，改變菌絲的形態(tài)及超微結構［3］，而且還能誘導馬鈴薯組織產生抗病性［4］。活性氧(reactive oxidative specifies，ROS)因在植物防御中具有關鍵作用而成為目前的研究熱點，主要表現(xiàn)在ROS不但具有直接的抗微生物功能［5］，而且參與細胞壁木質化及富含羥脯酸的糖蛋白的交聯(lián)而抵御病原菌侵染［6］。此外，ROS還作為第二信使調控抗病相關基因的表達，并引起過敏性細胞死亡，啟動植物抗病防御反應［7］。本實驗以大西洋馬鈴薯(cv.Atlantic)塊莖為試材，研究了殼聚糖處理及干腐病菌Fusarium sulphureum挑戰(zhàn)接種對馬鈴薯塊莖組織活性氧代謝的影響，以期為代替化學合成藥物控制馬鈴薯塊莖干腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

馬鈴薯塊莖 品種為大西洋，塊莖于2008年9月份采自甘肅省農牧廳秦王川高新技術園區(qū)，網(wǎng)袋包裝后運抵實驗室冷庫低溫(16±2℃)貯藏待用;馬鈴薯干腐病病原物硫色鐮刀菌(Fusarium sulphureum Schlechlendahl) 由甘肅省農業(yè)科學院植物保護所提供;殼聚糖 濟南海得貝海洋生物工程有限公司(食品級，脫乙酰度為90.2%，粒度80目)。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料處理方法 參照 Sun等［4］及 Ray和Hammerschmidt方法［8］。用滅菌的接種環(huán)將 200μL 0.25%的殼聚糖溶液均勻涂布于事先切好并活化的馬鈴薯切片(厚10mm，直徑20mm)上，以無菌水處理為對照。挑戰(zhàn)接種是將在 PDA上培養(yǎng)7d的F.sulphureum配制成1×105個/mL的孢子懸浮液，并在處理后1d涂布于殼聚糖處理和對照的馬鈴薯切片，處理和接種后的切片均置于25±2℃的暗箱中。

1.2.2 測定方法 分別于0.25%殼聚糖處理和挑戰(zhàn)接種后1、2、3、4、5d 用不銹鋼刀切取馬鈴薯處理面下3～4mm處組織3g，用錫箔紙包好，液氮冷凍，在－80℃超低溫冰箱中保存待測。

各項指標重復3次。酶活性測定采用UV－2550分光光度計，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Excel和DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖處理及挑戰(zhàn)接種對馬鈴薯切片H2O2含量和產生速率的影響

殼聚糖處理可明顯提高馬鈴薯切片H2O2的含量和的產生速率(圖1)。對于H2O2處理者第2d就已高于對照，第3d和第4d顯著提高，分別高出同期對照的18.4%和20.7%，第5d與對照基本相等(圖1A)。而處理后第2d的的產生速率略低于對照，從第3d開始持續(xù)增高，第4d和第5d分別高出對照的46%和60%(圖1B)。F.sulphureum挑戰(zhàn)接種可顯著提高處理者和對照的H2O2含量和產生速率。

圖1 殼聚糖處理及挑戰(zhàn)接種對馬鈴薯切片H2O2(A)含量和(B)產生速率的影響

2.2 殼聚糖處理及挑戰(zhàn)接種對馬鈴薯切片SOD和CAT活性的影響

殼聚糖處理可顯著降低馬鈴薯切片的SOD活性(圖2A)。處理者第2d的SOD活性就開始明顯下降，第3d到第5d下降速度最快，其下降速度高于對照。F.sulphureum挑戰(zhàn)接種顯著加速了處理者和對照SOD活性的下降，挑戰(zhàn)接種后處理者的SOD活性顯著低于挑戰(zhàn)接種后的對照，第5d的活性低于同期對照20%。

圖2B表明，馬鈴薯切片的CAT活性可被殼聚糖處理誘導。處理后第1d處理者的CAT活性就已高于對照44.6%，以后隨著時間延長，CAT活性逐漸增加，第 4d達到峰值，高于同期對照 10.75%。F.sulphureum挑戰(zhàn)接種可顯著提高處理者和對照的CAT活性，與挑戰(zhàn)接種后的對照相比，挑戰(zhàn)接種后處理者的CAT活性高于同期對照的20.9%。

圖2 殼聚糖處理及挑戰(zhàn)接種對馬鈴薯切片SOD(A)和CAT(B)活性的影響

2.3 殼聚糖處理及挑戰(zhàn)接種對馬鈴薯切片APX和GR活性的影響

從圖3可見，殼聚糖處理對馬鈴薯切片APX和GR的活性具有一定影響。APX活性受到抑制，處理者第1d的APX活性就已低于對照63.8%，與對照相比，殼聚糖處理在5d范圍內均可抑制APX活性的提高。F.sulphureum挑戰(zhàn)接種可提高處理者和對照的APX活性，但差異不顯著(圖3A)。而對于GR處理后第2d活性就已高出對照55.4%，第4d達到最大，隨后其活性顯著下降。F.sulphureum挑戰(zhàn)接種降低了處理者和對照的GR活性，但殼聚糖處理者延緩了GR活性的降低(圖3B)。

2.4 殼聚糖處理及挑戰(zhàn)接種對馬鈴薯切片ASA含量的影響

圖3 殼聚糖處理及挑戰(zhàn)接種對馬鈴薯切片APX(A)和GR(B)活性的影響

殼聚糖處理明顯提高了馬鈴薯切片AsA含量(圖4)。隨時間的延長對照和處理者的AsA含量均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，第4d的AsA含量均達到最大，且處理者AsA含量高出對照39.9%。F.sulphureum挑戰(zhàn)接種加速了處理者和對照AsA含量的降低速率，但處理者AsA含量的降低速率低于對照，兩者之間無顯著性差異。

圖4 殼聚糖處理及挑戰(zhàn)接種對馬鈴薯切片AsA含量的影響

3 討論

植物體內ROS代謝中，SOD、POD和CAT是清除ROS過程中最重要的抗氧化酶，SOD清除轉化為H2O2和O2，CAT和POD清除H2O2使之轉化為H2O［21－22］。本研究中殼聚糖處理及 F.sulphureum 挑戰(zhàn)接種可明顯降低馬鈴薯切片SOD活性，這可能與殼聚糖處理誘導產生速率增高有關。這與誘抗劑在其它寄主上研究有一定的差異。一般由親和性互作引起感病反應中SOD活性升高。如在受銹菌侵染的菜豆葉片，TMV侵染的煙草葉片，線蟲侵染的番茄和豌豆根部組織中，SOD的活性明顯增加，而且與癥狀的表現(xiàn)有關。但在非親和性反應中，SOD活性無多大變化，甚至下降。如挑戰(zhàn)接種TMV或根結線蟲的番茄抗病品種的葉片或根部中，SOD活性明顯下降;而受稻瘟菌非親和小種侵染的水稻葉片中，SOD活性無顯著變化［23］。殼聚糖處理提高了馬鈴薯切片CAT活性，該結果與舒英杰等［24］發(fā)現(xiàn)殼聚糖處理黃瓜種子，提高了幼苗CAT活性的結論相一致。宋世清等［25］研究發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫下殼聚糖處理可以提高黃瓜幼苗CAT活性，李紅斌等［26］發(fā)現(xiàn)，噴施殼聚糖的黃瓜幼苗在熱脅迫下8h內體內活性氧清除主要酶類SOD、CAT明顯提高。

AsA－GSH循環(huán)是一個重要的清除H2O2的系統(tǒng)，APX和GR是抗壞血酸－谷胱甘肽(AsA－GSH)循環(huán)的關鍵酶。其中APX是關鍵酶，APX是利用AsA為電子供體的H2O2的清除，GR利用NADPH作為輔助因子而將GSSG還原成GSH，AsA和GSH是AsAGSH循環(huán)中的兩種重要抗氧化成分［27－28］。本實驗中殼聚糖處理及F.sulphureum挑戰(zhàn)接種明顯促進了馬鈴薯切片GR活性，而抑制了APX活性，該結果與王益光等［17］用1%殼聚糖涂膜處理在楊梅果實研究結論相一致。馬鈴薯切片AsA含量被殼聚糖處理誘導，同時挑戰(zhàn)接種有效抑制了處理者AsA含量的降低速率，提高了它的抗氧化水平，這可能是因為病原菌的侵染會引起植物體內GSH和AsA等抗氧化物質含量的增加［29］。

綜上所述，殼聚糖處理能明顯促進馬鈴薯切片H2O2和AsA的積累，提高產生速率，增加CAT和GR活性，降低SOD和APX活性，F(xiàn).sulphureum挑戰(zhàn)接種可進一步提高處理者及對照H2O2含量和產生速率，CAT、APX和GR活性，但降低了SOD活性以及AsA含量。可見殼聚糖和病原物可通過誘導氧迸發(fā)(oxidative burst)而啟動馬鈴薯組織的抗病反應。至于殼聚糖對抗氧化酶的作用機理，還有待進一步研究。

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Effect of chitosan treatment on reactive oxygen species metabolism in potato tuber slices

LI Yong－cai1，SUN Xiao－juan1，2，BI Yang1，*
(1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;2.Agricultural Technology Centre of Tibetan Autonomous County of Tianzhu，Tianzhu 733200，China)

TS201.2

A

1002－0306(2010)08－0313－04

2009－09－29 *通訊聯(lián)系人

李永才(1973－)，男，副教授，博士，研究方向:果蔬采后貯藏保鮮與病害控制。

農業(yè)部農業(yè)公益性行業(yè)科研專項經費項目(NYHYZX 07－6);甘肅省農業(yè)生物技術項目(GNSW－2005－08)。