巨大口蘑和草菇貯藏期間褐變及相關酶活性研究

楊春敏，莫美華

(華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642)

巨大口蘑和草菇貯藏期間褐變及相關酶活性研究

楊春敏，莫美華*

(華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642)

把巨大口蘑和草菇貯藏在15℃、濕度為90%左右的條件下，分別對它們褐變相關的多酚氧化酶、酪氨酸酶和漆酶活性進行測定。結果顯示:巨大口蘑多酚氧化酶活性整體呈下降趨勢，新鮮和貯藏4d后的酶活性分別為138.89、97.78U·mL-1·min-1·FW。草菇多酚氧化酶活性變化呈上升趨勢，新鮮和貯藏4d后的多酚氧化酶活性分別為185.56、608.89U·mL-1·min-1·FW;巨大口蘑酪氨酸酶活性略高于草菇，兩者均呈下降趨勢;巨大口蘑漆酶活性變化呈先升高后下降趨勢，貯藏3d后達到峰值1.35U·mL-1·min-1·FW。而草菇漆酶活性均低于0.1U·mL-1·min-1·FW，且呈下降趨勢。巨大口蘑褐變速度比草菇慢，貯藏7d后，巨大口蘑和草菇褐變度分別為5.38%、29.86%。

多酚氧化酶，酪氨酸酶，漆酶，褐變度

Abstract:Tricho/oma giganteum and Vo/varie//a vo/vacen were stored in 15℃and humidity of 95%.The changes in browing and the activities of polyphenol oxidase(PPO)，Tyrosinase(TYE)and Lacease of Tricho/oma giganteum and Vo/varie//a vo/vacen were investigated.The results showed that:The activity of PPO of Tricho/oma giganteum was downtrend during storage，and the activity of PPO of fresh and 4d after storage of Tricho/oma giganteum were 138.89 and 97.78U·mL-1·min-1·FW，respectively.The activity of PPO of Vo/varie//a vo/vacen rose during storage，and the activity of PPO of fresh and 4d after storage of Vo/varie//a vo/vacen were 185.56 and 608.89U·mL-1·min-1·FW，respectively.The activity of TYE of Tricho/oma giganteum slightly higher than that of Vo/varie//a vo/vacen，and both the activities of TYE were downtrend.The activity of laccase of Tricho/oma giganteum rose initially and then dropped，with the highest activity of laccase reached 1.35U·mL-1·min-1·FW on 3d after storage.The activity of laccase of Vo/varie//a vo/vacen was downtrend and lower than 0.1U·mL-1·min-1·FW during storage.The browning speed of Tricho/oma giganteum was slower than that of Vo/varie//a vo/vacen during storage.7d after storage，the browning degree of Tricho/oma giganteum and Vo/varie//a vo/vacen were 5.38%and 29.86%，respectively.

Key words:polyphenol oxidase;tyrosinase;laccase;browning degree

食用菌在貯運加工過程中常發(fā)生組織褐變，風味變劣，嚴重影響外觀品質和營養(yǎng)品質，導致商品價值低下，經濟損失嚴重［1］。褐變一般可分為兩大類:一類是在氧化酶催化下的多酚類物質的氧化變色，稱為酶促褐變;另一類是沒有酶參與的非酶褐變。而食用菌的褐變，主要是多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)引起的酶促褐變［2］。酶學界根據 PPO催化的底物不同和底物中酚羥基的位置和數目將多酚氧化酶分為三大類:單酚氧化酶［酪氨酸酶(tyrosinase，TYE)］、雙酚氧化酶［兒茶酚氧化酶(catechol oxidase)或鄰苯二酚氧化酶(o-diphenol oxadise)，對苯二酚氧化酶(p-diphenol oxadise)］和漆酶(lacease)［3-4］。有報道指出，酪氨酸酶是導致雙孢蘑菇褐變的關鍵酶［5］;草菇褐變主要由多酚氧化酶和蛋白酶作用導致［6-7］。通過前期研究發(fā)現:巨大口蘑子實體可在8～12℃條件下保存30d而不變色、不腐爛、不生蟲，耐貯運性很好［8］。為了探明巨大口蘑抗褐變的機理，測定了在貯藏期間巨大口蘑和草菇的褐變度及其與之相關的酶活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巨大口蘑 廣東省連南食用菌研究所(陳秋來提供);草菇 廣州市花都雙崗草菇場;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 廣州化學試劑廠，分析純;鄰苯二酚國藥集團化學試劑有限公司，化學純;鄰聯(lián)甲苯胺上海晶體試劑有限公司，分析純;冰醋酸 天津市大茂化學試劑廠，分析純。

MP402B電子天平 中國上海精科天平廠;LRH-250-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 中國廣東省醫(yī)療器械廠;GL21低溫冷凍離心機 德國Eppendorf公司;XMT-DA電熱恒溫干燥箱 中國廣州市康恒儀器有限公司;UV-7500紫外可見分光光度計 中國上海精密科學儀器有限公司;DK-8D電熱恒溫水浴鍋中國上海精密實驗設備有限公司;DC-P3全自動色差計 中國北京市興光測色儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 貯藏方法 挑選新鮮無病蟲的蘑菇子實體，分裝于塑料保鮮袋中，在15℃生化培養(yǎng)箱中貯藏。定期取樣測定兩種菇的酶活性和褐變度，設3個重復。所得數據采用Excel和SAS V9.0版軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.2 多酚氧化酶活性測定方法 參照Zauberman等［9-10］，取 4.00g 菇子實體，洗凈，放入研缽中，按 1∶5(W/V)加入0.05mol磷酸緩沖液(pH6.8，含2.5%PVP)，冰浴研磨，于4℃、8500r/min 離心15min，上清液作為酶提取液。PPO測定體系為2.5mL，其中0.05mol磷酸緩沖液(pH6.8)1.95mL與0.1mol鄰苯二酚0.5mL混合后預熱至25℃，然后迅速加入PPO提取液50μL，混勻，記錄波長420nm處OD值在3min內的變化。一個酶活性單位(U)定義為:在上述實驗條件下，每分鐘引起OD值改變0.001所需的酶量。

1.2.3 酪氨酸酶活性測定方法 參照文獻［11-12］，并結合實驗特點加以修改，步驟如下:取洗凈的蘑菇子實體，用吸水紙吸干表面水分后稱取4.00g，將其切成小塊，加入10mL預冷的pH6.8的磷酸鹽緩沖液(含0.1mol/L NaF)中，冰浴研磨勻漿，然后在冷凍離心機中離心(4℃，5000r/min，20min)。測定參照蔣萌蒙等的方法進行［13］，即在比色皿中分別加入3.9mL含1mmol/L L-酪氨酸的磷酸鹽緩沖液(pH6.8)，然后加入0.1mL酶液并迅速混勻，立即用紫外可見分光光度計在317nm處測定吸光值的變化，連續(xù)測定10min。以吸光率增加的最初直線段斜率來計算酶活力。酶活力單位(U)定義為:測定條件(20℃)下每分鐘引起OD值變化0.1為1個酶活力單位。

1.2.4 漆酶活性測定方法 參照潘迎捷等［14］，取4.00g菇子實體，加入 25mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.0)20mL混合，冰浴研磨，于4℃、8500r/min離心15min，取上清液待用。漆酶活性測定體系為:0.5mL 3.36mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺，3.4mL 0.1mol/L醋酸緩沖液(pH=4.6)和0.1mL酶液，25℃反應10min。酶活性以600nm吸光率的增值表示。一個酶活性單位(U)定義為:在上述實驗條件下，每分鐘引起OD值改變0.1所需的酶量。

1.2.5 褐變度測定方法 采用DC-P3全自動色差計。用標準陶瓷板(X=80.00，Y=83.00，Z=90.00)作為工作標準，測量蘑菇子實體內部組織切面及菌褶部切面的白度值。用L表示。L值越大，表示顏色越白，褐變越輕。L-0為黑色，L-100為白色。定義褐變度為相對于貯藏前白度值變化的百分率。計算公式如下:

褐變度(%)=(貯前白度值-貯后白度值)/貯前白度值×100%

2 結果與分析

2.1 多酚氧化酶活性測定結果

巨大口蘑和草菇PPO活性測定結果如表1。從表1可知，無論是新鮮的還是不同貯藏時間的巨大口蘑的PPO活性均明顯低于草菇的PPO活性，差異均達到了極顯著水平，如新鮮的巨大口蘑和草菇PPO活性分別為185.56、138.89U·mL-1·min-1·FW，貯藏4d后巨大口蘑PPO活性下降為97.78U·mL-1·min-1·FW;而草菇PPO活性上升達到峰值608.89U·mL-1·min-1·FW。此時草菇已開始褐變、腐爛。隨著貯藏時間的延長，巨大口蘑PPO活性均維持較低水平，剛采摘的酶活性相對較高，達到了138.89U·mL-1·min-1·FW，然后迅速下降到一個最低水平85.33U·mL-1·min-1·FW，然后又開始緩慢上升，貯藏到第7d時酶活性為120U·mL-1·min-1·FW，但仍低于新鮮巨大口蘑的PPO活性。草菇PPO活性呈現迅速上升趨勢，貯藏到第4d已達到峰值，隨后略有下降，但貯藏7d后PPO活性仍比新鮮的高。

2.2 酪氨酸酶活性測定結果

巨大口蘑和草菇酪氨酸酶活性測定結果列入表2。從表2可知，巨大口蘑和草菇TYE活性差異達到極顯著水平，不同貯藏時期的巨大口蘑TYE活性均高于草菇TYE活性，兩者整體上都呈下降趨勢，0d時巨大口蘑和草菇TYE活性分別為0.56U·mL-1·min-1·FW和0.37U·mL-1·min-1·FW，貯藏到第7d時巨大口蘑和草菇TYE活性分別減小到0.32U·mL-1·min-1·FW 和 0.10U·mL-1·min-1·FW。

2.3 漆酶活性測定結果

巨大口蘑和草菇漆酶活性測定結果如圖1。由圖1顯示，巨大口蘑漆酶活性高于草菇漆酶活性，兩者差異極顯著。巨大口蘑漆酶活性整體上呈先增加后減小的趨勢，到第3d時達到最大值1.35U·mL-1·min-1·FW，然后開始下降。草菇漆酶活性在貯藏期間都維持在一個較低水平0.1U·mL-1·min-1·FW以下，且呈下降趨勢。草菇漆酶活性的變化很小。剛采摘時，巨大口蘑和草菇漆酶活性分別為0.39U·mL-1·min-1·FW 和0.07U·mL-1·min-1·FW;貯藏3d后，巨大口蘑漆酶活性達到峰值1.35U·mL-1·min-1·FW，草菇漆酶活性為0.04U·mL-1·min-1·FW。

2.4 褐變度測定結果

巨大口蘑和草菇褐變度結果如圖2。從圖2也可以看到巨大口蘑褐變比草菇緩慢得多，巨大口蘑貯藏7d后，褐變度僅為5.38%，而草菇貯藏7d后，褐變度已達到29.86%。從這一結果看出，兩種蘑菇的褐變度變化趨勢與它們的PPO活性變化趨勢是一致的。這是因為蘑菇褐變主要是由多酚氧化酶催化組織中的酚類物質氧化引起的［15］，所以PPO活性增強，這必將導致褐變速率加快。

表1 巨大口蘑和草菇PPO活性比較(U·mL-1·min-1·FW)

表2 巨大口蘑和草菇酪氨酸酶活性比較(U·mL-1·min-1·FW)

圖1 兩種菇漆酶活性隨貯藏時間的變化趨勢

圖2 不同貯藏時間巨大口蘑和草菇的褐變度

3 結論與討論

酶促褐變是酚酶催化酚類物質形成醌及其聚合物的反應過程。酶促褐變必須具備3個條件:酚類底物、酚氧化酶和氧。一般認為，食用菌的酶促褐變主要是由于富含在組織中的PPO催化酚類物質的氧化反應所引起的［16-17］。

貯藏期間，巨大口蘑和草菇中三種褐變相關的酶活性比較表明:巨大口蘑PPO活性呈下降趨勢，草菇PPO活性呈上升趨勢且明顯高于巨大口蘑PPO活性，說明草菇的褐變與PPO活性密切相關;巨大口蘑TYE活性略高于草菇TYE活性，且兩者變化都呈下降趨勢;巨大口蘑的漆酶活性也高于草菇漆酶活性，草菇漆酶活性在整個貯藏期間走勢平緩，活性強度很低，說明漆酶不是引起草菇褐變的關鍵酶，這一結果與王樂芬等［5］研究雙孢蘑菇中漆酶的活性相似。從以上結果中，可以推斷漆酶和酪氨酸酶不是引起草菇褐變的主要催化酶，因為這兩種酶的活性都不高，且呈下降趨勢;而草菇在貯藏期間PPO活性很高，褐變速度快，這一結果與榮瑞芬等［18］研究結果一致，由此推測可能是另外一種多酚氧化酶兒茶酚酶在草菇褐變中起了關鍵作用，這還需要進一步的實驗證實。巨大口蘑在貯藏中PPO活性低，且隨著貯藏期延長，活性降低，褐變速度慢，因此推測巨大口蘑抗褐變性與其子實體中PPO活性低有關。另外，雖然巨大口蘑漆酶活性遠比草菇的漆酶活性還高，但是巨大口蘑不容易褐變，而草菇很容易褐變，由此推測漆酶不是引起兩種蘑菇褐變的關鍵酶。酪氨酸酶是不是引起巨大口蘑褐變的關鍵酶，尚需進一步的實驗證實。

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Study on browning and the activity of related enzyme of Vo/varie//a vo/vacen and Tricho/oma giganteum during storage

YANG Chun-min，MO Mei-hua*
(College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

TS201.2

A

1002-0306(2010)08-0320-04

2009-09-22 *通訊聯(lián)系人

楊春敏(1983-)，女，碩士研究生，研究方向:微生物資源開發(fā)與利用。