核磁共振法同時(shí)測(cè)定桔子原汁中主要糖類(lèi)和檸檬酸

閻政禮，楊明生

(1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410006;2.湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410081)

核磁共振法同時(shí)測(cè)定桔子原汁中主要糖類(lèi)和檸檬酸

閻政禮1，楊明生2，*

(1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410006;2.湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410081)

采用核磁共振波譜分析技術(shù)，確定桔子原汁中葡萄糖、果糖、蔗糖及檸檬酸在重水中的各種構(gòu)型，對(duì)桔子原汁中葡萄糖、果糖、蔗糖及檸檬酸進(jìn)行指紋歸屬。運(yùn)用模擬譜證實(shí)了桔子原汁中存在葡萄糖、果糖、蔗糖和檸檬酸。以鄰苯二甲酸氫鉀作內(nèi)標(biāo)，利用質(zhì)子核磁共振譜的主要特征峰同時(shí)對(duì)桔子原汁中葡萄糖、果糖、蔗糖及檸檬酸進(jìn)行定量分析。葡萄糖、果糖、蔗糖和檸檬酸測(cè)定結(jié)果的RSD(n=6)分別為3.61%、3.24%、2.19%、4.6%;葡萄糖、果糖、蔗糖和檸檬酸的回收率分別為99.4%、98.8%、97.8%、95.7%。該方法取樣量少、簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可以同時(shí)測(cè)定桔子原汁中葡萄糖、果糖、蔗糖和檸檬酸含量。

桔子原汁，葡萄糖，果糖，蔗糖，檸檬酸，NMR

Abstract:Various configurations of glucose，fructose，sucrose and citric acid in raw orange juice were determined by NMR when dissolved in heavy water.Glucose，fructose，sucrose and citric acid were attributed by fingerprint.Simulated spectra confirmed glucose，fructose and sucrose citric acid’s existence in raw orange juice.Potussium biphthalate was selected as an internal standard，1H－NMR spectra was used to determine the content of glucose，fructose and sucrose citric acid at the same time.RSD(n=6)of glucose，fructose and sucrose citric acid were 3.61%，3.24%，2.19%and 4.6%respectively，recovery of them were 99.4%，98.8%，97.8%and 95.7%，respectively.This method used only a little sample and was simple，rapid，accurate and suitable for the determination of the contents of glucose，fructose，sucrose and citric acid in raw orange juice at the same time.

Key words:raw orange juice;glucose;fructose;sucrose;citric acid;NMR

桔子果肉和果汁中含有豐富的葡萄糖、果糖、蔗糖、蘋(píng)果酸、拘椽酸、檸檬酸以及胡蘿卜素、硫胺素、核黃素、尼克酸、抗壞血酸等。測(cè)總糖含量的方法有鹽酸—酚法［1］、蒽酮比色法［2］等，測(cè)還原糖含量方法有直接法［3］、間接法［4］、3，5－二硝基水楊酸法［5］等。這些方法只能測(cè)出桔子原汁中還原糖和總糖的含量，若選用傳統(tǒng)方法來(lái)檢測(cè)桔子原汁，不但步驟多、操作復(fù)雜，且偏差較大。高效液相色譜法雖然可對(duì)葡萄糖、果糖、蔗糖單個(gè)含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，但涉及的條件多，操作復(fù)雜。檸檬酸的測(cè)定有高效液相色譜法［6］以及衍生化氣相色譜法［7］，衍生化氣相色譜法裝置較貴，操作繁瑣，應(yīng)用不普遍。目前，核磁共振技術(shù)在有機(jī)合成及天然提取的化合物的結(jié)構(gòu)鑒定上應(yīng)用非常廣泛，也常用于醫(yī)用藥物的定性、定量鑒定。而對(duì)桔子原汁混合體系中葡萄糖、果糖、蔗糖及檸檬酸含量采用核磁共振技術(shù)進(jìn)行定性、定量研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在利用核磁共振技術(shù)，建立一種快速、準(zhǔn)確而又同時(shí)測(cè)定桔子原汁中葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸的含量的方法，以加快柑桔品質(zhì)鑒定的檢測(cè)速度，在實(shí)現(xiàn)與國(guó)際檢測(cè)技術(shù)接軌等方面有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄糖、果糖蔗糖、檸檬酸、鄰苯二甲酸氫鉀均為分析純;重水 氘代度:99.8%;DSS。

AVANCE 500MHZ超導(dǎo)傅立葉變換核磁共振儀Bruker，瑞士;Sartorius電子天平 德國(guó);DS－1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠制造;Eppendorf 5804R冷凍高速離心機(jī) 德國(guó);離心機(jī) 湖南儀器儀表總廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 首先將桔子的非可食部分剝?nèi)?，稱(chēng)取約200g剝好的桔子，均勻放置在刀片桿兩側(cè)，固定好搗碎機(jī)的杯子，打開(kāi)電源，以10000r/min搗碎約5min，取出均漿，用紗布濾去渣滓，再將濾液置于厚質(zhì)的50mL冷凍離心管中，以5000r/min，在冷凍高速離心機(jī)中離心10min，后用5mL移液槍取出上清液，置上清液于試劑瓶中，冷藏備用，離心管中殘?jiān)鼦壢ァ?/p>

1.2.2 樣品配制

1.2.2.1 1號(hào)樣品 量取約5mL上述備用的蜜桔原汁樣品冷凍干燥，除去水，用0.6mL重水溶解，轉(zhuǎn)移至5mm的核磁共振樣品管中。用于測(cè)定1H－NMR譜、H－H COSY 譜、13C－NMR 譜、DEPT譜、HSQC 譜、HMBC譜。

1.2.2.2 2號(hào)樣品 取0.5g蜜桔原汁于核磁共振樣品管中，加10mg鄰苯二甲酸氫鉀，加0.2mL重水，用于精密度測(cè)試。

1.2.2.3 3號(hào)樣品 取0.5g蜜桔原汁于核磁共振樣品管中，加10mg鄰苯二甲酸氫鉀，加0.2mL重水，測(cè)試后分別加入與樣品相當(dāng)量的葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸，用于回收率測(cè)試。

1.2.2.4 4、5、6號(hào)樣品 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取約2g蜜桔、砂糖桔、贛南橙原汁樣品及約50mg鄰苯二甲酸氫鉀于5mL的具磨口塞的離心試管中，加0.5mL重水，搖勻。取約0.6mL于5mm的核磁共振樣品管中，用于測(cè)定1H－NMR譜。

以上準(zhǔn)確稱(chēng)取的標(biāo)準(zhǔn)和樣品都精確到0.1mg。樣品配制好后，放置15min，待溶液穩(wěn)定后進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)核磁樣品管測(cè)量6次。

1.2.31H－NMR譜測(cè)試條件 將制好的樣品充分振搖，待樣品及標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解，放置15min，待溶液穩(wěn)定后進(jìn)行測(cè)定。每次測(cè)定都進(jìn)行調(diào)諧、勻場(chǎng)，測(cè)定條件控制在:T:300K，SF:500.13MHz，SWH:5376.344，NS:64，DS:2，每個(gè)核磁樣品管測(cè)量6次。譜圖處理時(shí)以DSS確定化學(xué)位移零點(diǎn)，積分時(shí)先對(duì)譜圖峰形和基線進(jìn)行校正，后對(duì)需積分的每個(gè)峰進(jìn)行基線校正，保證積分值的準(zhǔn)確。

表1 蜜桔原汁中三種主糖、檸檬酸的1H－NMR歸屬

1.2.4 定量依據(jù) 利用吸收峰面積與氫質(zhì)子數(shù)成正比，通過(guò)加入標(biāo)準(zhǔn)物作內(nèi)標(biāo)，可以準(zhǔn)確求出桔子原汁中葡萄糖、果糖、蔗糖和檸檬酸含量(mg)。葡萄糖的積分值為α－D－吡喃葡萄糖及β－D－吡喃葡萄糖的端基質(zhì)子積分值之和，若要計(jì)算葡萄糖兩種構(gòu)型比值，可計(jì)算兩種構(gòu)型積分比。果糖積分值為β－D－吡喃果糖、α－D－呋喃果糖和β－D－呋喃果糖三種構(gòu)型積分值之和，果糖四個(gè)峰正好包含了果糖三種構(gòu)型每種構(gòu)型兩個(gè)質(zhì)子，因此，計(jì)算果糖含量時(shí)應(yīng)除以二。蔗糖的積分值即為α－D－吡喃葡萄糖環(huán)上1－H的積分值。

圖1 三種主要糖類(lèi)及檸檬酸在重水中的構(gòu)型

式中WS:樣品質(zhì)量;AS:樣品質(zhì)子吸收峰面積;nS:樣品吸收峰所包含質(zhì)子數(shù);WR:標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量;AR:標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)子吸收峰面積;nR:標(biāo)準(zhǔn)吸收峰所包含質(zhì)子數(shù);MS:樣品摩爾質(zhì)量;MR:標(biāo)準(zhǔn)摩爾質(zhì)量;其中S為葡萄糖、果糖、蔗糖和檸檬酸;R為鄰苯二甲酸氫鉀;M葡萄糖=180，M果糖=180.13，M蔗糖=342.3，M鄰苯二甲酸氫鉀=204.23，M檸檬酸=192.13。

表2 蜜桔原汁中三種主糖、檸檬酸的13C－NMR譜歸屬

2 結(jié)果與討論

2.1 蜜桔原汁中主要糖類(lèi)及檸檬酸的1H－NMR譜和13C－NMR譜的歸屬

根據(jù)冷凍干燥的蜜桔原汁、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)、果糖標(biāo)準(zhǔn)、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)的1H－NMR譜、H－H COSY譜、13C－NMR 譜、DEPT譜、HSQC 譜、HMBC 譜，確定桔子原汁存在葡萄糖、果糖、蔗糖和檸檬酸，其中，葡萄糖以α－D－吡喃葡萄糖和β－D－吡喃葡萄糖兩種主要構(gòu)型存在。果糖主要以β－D－吡喃果糖、α－D－呋喃果糖和β－D－呋喃果糖三種主要構(gòu)型存在，在三種構(gòu)型中，β－D－吡喃果糖含量最高，其次為β－D－呋喃果糖，α－D－呋喃果糖含量最低。蔗糖及檸檬酸在重水中只有一種構(gòu)型。根據(jù)圖2和圖3對(duì)桔子原汁中葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸進(jìn)行了指紋歸屬，歸屬順序如圖1，具體歸屬如表1及表2。1H－NMR譜中，δ:5.217為 α－D－吡喃葡萄糖 1－H，受 2－H 的偶合而裂分為雙峰，偶合常數(shù)3JH－H=3.5Hz;δ:4.628 為β－D－吡喃葡萄糖1－H，受2－H的偶合而裂分為雙峰，偶合常數(shù)3JH－H=8.0Hz。δ:5.392 為蔗糖 1－H，受蔗糖2－H的偶合而裂分為雙峰，偶合常數(shù)3JH－H=3.5Hz;δ:4.198 歸屬為蔗糖 6'－H，受蔗糖5'－H 的偶合而裂分為雙峰，偶合常數(shù)3JH－H=9.0Hz。δ:2.891，δ:2.756為檸檬酸的兩個(gè)亞甲基吸收峰。由于兩個(gè)CH2與手性碳原子相連，導(dǎo)致兩個(gè)CH2上的2個(gè)質(zhì)子磁不等價(jià)，產(chǎn)生同碳偶合，具有不同的化學(xué)位移值，偶合常數(shù)2JH－H=15Hz。

圖2 冷凍干燥的蜜桔原汁1H－NMR譜

冷凍干燥的蜜桔原汁的13C－NMR譜如圖3所示，給出18個(gè)果糖碳信號(hào)，其中，δ:107.109為α－D－呋喃果糖的2－C，δ:104.163為β－D－呋喃果糖的2－C，δ:100.731為 β－D－吡喃果糖2－C。在冷凍干燥的蜜桔原汁的13C－NMR譜中，給出12個(gè)葡萄糖碳信號(hào)，其中，δ:94.747 為 α－D－吡喃葡萄糖的 1－C，δ:98.563為β－D－吡喃葡萄糖的1－C。圖3還給出了12 個(gè)蔗糖碳信號(hào)，δ:94.810 為 1－C，δ:106.322 為1'－C。冷凍干燥的蜜桔原汁13C－NMR譜中，給出6個(gè)檸檬酸碳信號(hào)，其中，δ:177.601為1－C和6－C的羰基碳，δ:181.531為 4－C 的羰基碳，δ:46.425為2－C 和5－C的亞甲基碳。

通過(guò)以上譜圖，可以對(duì)冷凍干燥的蜜桔原汁中葡萄糖的二種構(gòu)型、果糖的三種構(gòu)型、蔗糖、檸檬酸進(jìn)行指紋歸屬，葡萄糖與果糖在重水中的構(gòu)型及相對(duì)含量與資料報(bào)道相符［8］。

圖3 冷凍干燥的蜜桔原汁13C－NMR譜

2.2 蜜桔原汁樣品冷凍干燥譜與模擬譜的比較

從圖4和圖5可以看出，冷凍干燥的蜜桔原汁中葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸與葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸模擬譜中1H－NMR譜和13C－NMR譜的峰型和位置基本一致，蔗糖在蜜桔原汁含量較高，而檸檬酸在桔子原汁含量較低，這一點(diǎn)從蜜桔原汁1H－NMR和13C－NMR譜可以看出。

圖4 蜜桔原汁1H－NMR譜(a)與模擬的1H－NMR譜(b)比較

2.3 蜜桔原汁中三種主糖、檸檬酸和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)子特征峰的確定

蜜桔原汁的1H－NMR譜中，如圖6，δ:5.394為蔗糖1－H，與其它峰不重疊，利用它作為質(zhì)子特征峰對(duì)蔗糖進(jìn)行定量。δ:5.217為α－D－吡喃葡萄糖的1－H，δ:4.629歸屬為β－D－吡喃葡萄糖的1－H ，兩者之和即為葡萄糖的總積分值。δ:4.100～4.092為α－D－呋喃果糖3－H 和 β－D－呋喃果糖3－H、4－H，δ:4.018～3.993歸屬為β－D－吡喃果糖6－H上一個(gè)質(zhì)子兩重峰與α－D－呋喃果糖4－H兩個(gè)峰中一個(gè)峰。δ:3.984～3.976歸屬為β－D－吡喃果糖5－H與α－D－呋喃果糖4－H兩個(gè)峰中另一個(gè)峰。這三個(gè)區(qū)間正好包含了果糖三種構(gòu)型每種構(gòu)型兩個(gè)質(zhì)子，而β－D－吡喃果糖6－H上一個(gè)質(zhì)子兩重峰中一個(gè)峰與蔗糖的5'－H上三重峰中一個(gè)峰重疊，因此，在計(jì)算果糖積分值時(shí)，應(yīng)把 δ:3.984～3.976、δ:4.053～4.018、δ:3.993～3.976這三個(gè)區(qū)間的積分值相加再減去蔗糖的1－Hδ:5.394積分值，即為果糖三種構(gòu)型每種構(gòu)型兩個(gè)質(zhì)子的積分值，除以二，即為果糖的總積分值。δ:2.873兩重峰和δ:2.753兩重峰皆為檸檬酸兩個(gè)質(zhì)子，任選一組積分值除以二，即可對(duì)檸檬酸進(jìn)行定量。δ:7.561～7.740為鄰苯二甲酸氫鉀的兩組多重峰，任選一組峰進(jìn)行積分都為兩個(gè)質(zhì)子。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 蜜桔原汁13C－NMR譜(a)與模擬的13C－NMR譜(b)比較

圖6 蜜桔原汁加內(nèi)標(biāo)的1H－NMR譜

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

測(cè)試時(shí)，將樣品進(jìn)行6次平行測(cè)定，按照公式計(jì)算蜂蜜中葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸的百分含量，計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表3。

從表3可以看出:葡萄糖、果糖、蔗糖和檸檬酸測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.61%、3.24%、2.19%、4.6%，多次測(cè)定結(jié)果接近，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差亦在允許范圍內(nèi)，說(shuō)明定量的精密度令人滿意。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

測(cè)試時(shí)，每個(gè)蜜桔原汁樣品添加標(biāo)準(zhǔn)前測(cè)試6次，添加標(biāo)準(zhǔn)后測(cè)試6次，取葡萄糖、果糖、蔗糖和檸檬酸添加前后的量的均值，計(jì)算三種主要糖及檸檬酸的回收率，其結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出:葡萄糖回收率為99.4%，果糖回收率為98.8%，蔗糖的回收率為97.8%，檸檬酸回收率為95.7%，實(shí)驗(yàn)達(dá)到了回收的目的，這說(shuō)明核磁共振法測(cè)定桔子原汁準(zhǔn)確度高，分析測(cè)定結(jié)果可靠性強(qiáng)。

2.6 樣品檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)最佳條件測(cè)出蜜桔(1)、砂糖桔(2)、贛南橙(3)中葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸百分含量，結(jié)果如表5。

表5 桔子原汁檢測(cè)結(jié)果

由表5可以看出，蜜桔中葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸的百分含量分別為 0.65%、0.78%、2.46%、0.31%，砂糖桔中葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸的百分含量分別為1.94%、5.42%、4.28%、0.044%，贛南橙中葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸的百分含量分別為0.94%、2.09%、2.81%、0.45%。砂糖桔中葡萄糖、果糖、蔗糖的百分含量比蜜桔都高了幾倍，而砂糖桔中檸檬酸百分含量比蜜桔、贛南橙低了幾倍。

3 結(jié)論

應(yīng)用核磁共振法，可以確定桔子原汁中葡萄糖、果糖、蔗糖及檸檬酸在重水中的各種構(gòu)型，運(yùn)用模擬譜證實(shí)了葡萄糖、果糖、蔗糖和檸檬酸在桔子原汁中的存在。選用鄰苯二甲酸氫鉀作內(nèi)標(biāo)，通過(guò)相關(guān)質(zhì)子特征峰的積分值可以直接求出桔子原汁中葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸的絕對(duì)含量。葡萄糖、果糖、蔗糖和檸檬酸測(cè)定結(jié)果的 RSD(n=6)分別為3.61%、3.24%、2.19%、4.6%，誤差在允許范圍內(nèi);葡萄糖、果糖、蔗糖和檸檬酸的回收率為 99.4%，98.8%，97.8%，95.7%，回收率令人滿意。樣品測(cè)定結(jié)果表明:桔子原汁中葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸的測(cè)定結(jié)果接近真實(shí)值。本方法具有操作簡(jiǎn)便、快速，重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，為蜜桔、砂糖桔和贛南橙等混合體系中葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸的測(cè)定提供了一種簡(jiǎn)單、可行的方法。

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Determination of major sugars and citric acid in raw orange juice were by Nuclear Magnetic Resonance at the same time

YAN Zheng－li1，YANG Ming－sheng2，*
(1.College of Medicine，Hunan Normal Uinversity，Changsha 410006，China;2.College of Chemistry and Chemical Engineering，Hunan Normal Uinversity，Changsha 410081，China)

TS255.1

A

1002－0306(2010)08－0353－05

2009－07－08 *通訊聯(lián)系人

閻政禮(1966－)，男，研究生，主要從事食品衛(wèi)生研究。