不補料連續酶解-膜分離耦合制備魚鱗膠原蛋白抗氧化肽的研究

馬海樂，王中斌，駱 琳，何榮海

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013;2.江蘇省農產品生物加工與分離工程技術研究中心，江蘇鎮江212013)

不補料連續酶解-膜分離耦合制備魚鱗膠原蛋白抗氧化肽的研究

馬海樂1，2，王中斌1，駱 琳1，2，何榮海1，2

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013;2.江蘇省農產品生物加工與分離工程技術研究中心，江蘇鎮江212013)

以克服傳統酶解技術存在的不足，提高酶解反應效率為目的，研究了魚鱗膠原蛋白抗氧化肽制備的不補料連續酶解－膜分離耦合反應技術。從實驗得到的加酶量、底物濃度和循環泵轉速對蛋白轉化率的影響規律分析了酶膜耦合反應技術優于傳統的酶解技術的原因。通過正交實驗，得到最優的酶解工藝條件為:底物濃度4%(W/W)、加酶量1.5%、反應時間30min、反應溫度60℃、循環泵轉速120r/min和pH9.5，該條件下蛋白轉化率高達97.56%。

酶膜耦合，魚鱗膠原蛋白，抗氧化肽，蛋白轉化率

Abstract:To overcome disadvantage of conditional enzymatic hydrolysis and improve reaction effect，continuous coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation without material(CEHMS)feeding was used for preparation of antioxidant peptides from scale collagen.The reason why CEHMS was better than conditional enzymatic hydrolysis was analyzed from effectual rules of enzymatic dosage，substrate concentration and cycle pump speed on percent conversion of protein.The optimal conditions gotten from orthogonal test were:substrate concentration 4%(W/W)，enzymatic dosage1.5%，reaction time 30min，reaction temperature 60℃，cycle pump speed 120r/min and pH9.5.Under the optimal conditions，percent conversion of protein reached 97.56%.

Key words:coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation;scale collagen;antioxidant peptides;percent conversion of protein

近年來國內外關于魚鱗膠原蛋白利用的研究主要集中在提取技術方面［1－3］，經過酶解轉化成為功能多肽的報道尚較為鮮見。曾少葵［4］、涂宗財［5］等人研究了魚鱗膠原蛋白酶解技術，研究表明酶解產物具有顯著的抗氧化活性。但是實踐證明，采用傳統的酶解技術，隨著反應的進行，會出現產物抑制效應和多肽過度降解等問題。近年大量的研究證明，酶解－膜分離耦合技術可以克服傳統酶解技術存在的不足，顯著提高酶解反應效率和產物的活性［6－9］。為此，本課題組將酶解－膜分離耦合技術應用于魚鱗膠原蛋白抗氧化肽的制備，本文重點研究在不補料的情況下，底物濃度、加酶量、反應時間、反應溫度、循環泵轉速等因素對酶解制備抗氧化肽效果的影響。在此工作的基礎上，下一步課題組將研究連續補料的工作情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚鱗膠原蛋白 市售;濃硫酸 國產分析純;Alcalase 2.4L 諾維信(中國)生物技術有限公司。

Pellicon小型超濾系統 包括截留分子量為3kDa的纖維素平板膜，美國Millipore公司;PHS－3C精密pH計 上海精密科學儀器有限公司;AvantiJ－25高效離心機 美國貝克曼公司;凱氏定氮儀 常州誠和儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質含量的測定與轉化率的計算 蛋白含量的測定采用凱氏定氮法(GB/T5009.3－2003)。蛋白轉化率以膜過濾透過液中蛋白質含量占原料液中蛋白質含量百分比計算:

式中:X為蛋白轉化率，%;C0為原料液蛋白含量，mg/mL;V0為原料液總體積，mL;C1為透過液蛋白含量，mg/mL;V1為透過液總體積，mL。

1.2.2 不補料連續酶膜耦合反應操作的基本流程一定底物濃度的魚鱗膠原蛋白溶液→調節反應液pH、反應溫度→超濾泵轉速100r/min循環5min→加酶→進行酶解－膜分離耦合反應一定時間→收集透過液→測定底物蛋白轉化率

1.2.3 不補料連續酶膜耦合反應的單因素實驗 以Alcalase為反應用蛋白酶，采用截留分子量為3kDa的纖維素平板膜，在不補充料液的情況下，對魚鱗膠原蛋白進行連續循環的酶解－膜分離耦合反應。在Alcalase推薦的酶解溫度和pH下，考察酶解反應時間、底物濃度、加酶量、循環泵轉速對魚鱗膠原蛋白轉化率的影響，確定最佳酶解工藝。截留分子量3kDa的多肽由前期酶解產物的抗氧化實驗篩選所得。

各單因素的取值分別為:反應時間10、20、30、40、50、60min，加酶量 0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%，反應溫度 45、50、55、60℃，循環泵轉速 50、100、150r/min，底物濃度0.5%、1%、2%、3%、4%。其實在一般的酶解反應中，反應的溫度和pH使用蛋白酶的推薦值即可，但是酶膜耦合反應考慮到外循環可能會引起系統實際溫度發生變化，因此有必要研究料液溫度的影響。

1.2.4 不補料連續酶膜耦合反應的正交優化實驗在單因素實驗結果的基礎上，以底物蛋白轉化率為考察指標，以加酶量、反應溫度、反應液pH、反應時間、循環泵轉速和底物濃度為實驗因素，通過六因素三水平的正交實驗［11］(如表1所示)，優化確定不補料連續酶膜耦合反應制備抗氧化肽的最優工藝參數。

表1 不補料連續酶膜耦合反應正交實驗設計

2 結果與討論

2.1 不補料連續酶膜耦合反應單因素實驗結果

2.1.1 酶膜耦合反應時間對蛋白轉化率的影響 酶膜耦合反應條件:加酶量3%，反應溫度50℃，反應液pH9.0，底物濃度1.5%，循環泵轉速100r/min。反應時間對蛋白轉化率的影響如圖1所示。

由圖1可知，當酶膜耦合反應時間較短時，魚鱗膠原蛋白轉化率提高迅速，當反應時間高于40min時，魚鱗膠原蛋白的轉化率提升幅度趨于平緩。反應初期轉化率提高迅速的原因一方面是由于底物相對酶量而言比較充分;另一方面由于大分子底物蛋白的不斷伸展，肽鏈的解聚，有利于底物與蛋白酶的充分接觸、降解過程的進行。到了反應后期，底物逐漸不足，受酶催化蛋白質的解聚過程趨于結束，已經伸展的大分子蛋白大部分被蛋白酶催化降解，因此蛋白轉化率趨于穩定。

2.1.2 加酶量對蛋白轉化率的影響 酶膜耦合反應條件:反應溫度50℃，反應液pH9.0，底物濃度1.5%，循環泵轉速100r/min。不同加酶量下蛋白轉化率隨時間變化的曲線如圖2所示。

圖1 酶膜耦合反應時間對蛋白轉化率的影響

圖2 不同加酶量對蛋白轉化率的影響

由圖2可知，在相同的反應時間下，當加酶量小于1.5%時，底物蛋白轉化率隨加酶量的增加而提升較快，當加酶量高于1.5%時蛋白轉化率的增加不明顯，其直接的原因是此時底物蛋白已經被蛋白酶所飽和。低酶量下轉化率隨時間增加而增加的速率緩于加酶量高的情況，但超過線性增加階段的末端以后，低酶量對應的轉化率還持續以一個較高的速度增加，這個結果可能與采用酶膜耦合反應有一定的關系。酶膜耦合反應可以在酶解的同時持續不斷地將小分子的多肽分離出去，對于低酶量的情況，相對于傳統的酶解方法，有利于緩解酶量不足的現象，將蛋白酶繼續高效地用于殘存的可以被酶解的蛋白質。

2.1.3 反應溫度對蛋白轉化率的影響 酶膜耦合反應條件:加酶量 1.5%，反應液 pH9.0，底物濃度1.5%，循環泵轉速100r/min。不同反應溫度下蛋白轉化率隨時間變化的曲線如圖3所示。

圖3 不同反應溫度對蛋白轉化率的影響

由圖3可知，在不同的反應溫度下，蛋白轉化率隨時間的延長均呈現上升趨勢。蛋白轉化率隨著溫度的升高，先增加后減小，55℃時達到最大。而這與堿性蛋白酶推薦的最佳溫度50℃相差5℃，這主要是因為，推薦的溫度是在未使用膜過濾情況下的最適溫度，而使用了酶膜耦合反應方案后，料液通過管道到達膜裝置，在料液輸送過程中存在一定的熱量損失，需要予以補充。因此選擇55℃為后續實驗溫度。

2.1.4 底物濃度對蛋白轉化率的影響 酶膜耦合反應條件:加酶量1.5%，反應液pH9.0，反應溫度55℃，循環泵轉速100r/min。不同底物濃度下蛋白轉化率隨時間變化的曲線如圖4所示。

圖4 不同底物濃度對蛋白轉化率的影響

許學書的實驗發現［10］，對于傳統的酶解反應而言，底物濃度越高反應速率越低，許學書認為由于底物抑制所致，其實高濃度底物會產生高濃度的產物多肽，高濃度產物對反應的抑制效應是降低其反應速率的重要原因。由圖4可以看出，在底物濃度達到3%之前，底物濃度越高，反應速率隨時間的增加上升越快，這個結果說明酶膜耦合反應很好地消除了產物抑制效應。但當底物濃度超過3%時，酶解產生的多肽量過多因膜的過濾能力不足，出現了產物抑制，導致反應速率下降。因此后續實驗底物濃度選擇3%。

2.1.5 循環泵轉速對蛋白轉化率的影響 酶膜耦合反應條件:加酶量1.5%，反應液 pH9.0，反應溫度55℃，底物濃度3%。不同循環泵轉速下蛋白轉化率隨時間變化的曲線如圖5所示。

由圖5可知，循環泵的轉速高時，隨著時間的增加，蛋白質的轉化率迅速上升，但很快達到穩定階段的轉化點，其原因應當是快速循環，一方面有利于酶解出來的小分子多肽及時排出反應系統，另一方面液體循環的強化傳質作用有利于促進酶與底物的接觸，但20min后底物變得不足，快速的循環反而變得降低酶與底物的有效接觸。從100r/min這條曲線可以看出，對于較低的轉速，在轉化點30min以后，蛋白質的轉化率還以一定的速度上升，因此說明反應后期相對較低的循環速度，在不影響多肽排出的情況下，有利于促進蛋白質的酶解。圖5的啟示為，對于不補料的工作模式，采取先高速后低速的變速循環策略，應當有利于改善蛋白質的轉化率。

通過上述單因素實驗，得到較優的反應條件是:加酶量1.5%，反應溫度55℃，底物濃度3%(W/W)，循環泵轉速100r/min，反應時間40min，從圖5可以看出，該條件下蛋白轉化率為92.75%。

圖5 不同循環泵轉速對蛋白轉化率的影響

2.2 不補料連續酶膜耦合反應正交實驗結果

按照表1的實驗設計，完成的優化實驗研究結果如表2所示。

由表2可知，按照極差大小，影響抑制率的五個因素的主次順序依次為A＞E＞C＞F＞D＞B，即影響酶解液抑制率最大的是底物濃度，其次是反應時間，然后依次是反應溫度、循環泵轉速、反應液pH、加酶量。由于最佳組合沒有出現在正交表中，因此對最優組合進行驗證實驗，該條件下蛋白轉化率平均為97.56%，比單因素蛋白轉化率提高了5.19%。

3 結論

3.1 加酶量、底物濃度和循環泵轉速對蛋白轉化率的影響規律，證明了酶膜耦合反應技術在克服傳統酶解技術不足方面表現出顯著的優勢。

3.2 單因素實驗得到較優的酶解條件為:底物濃度3%(W/W)、加酶量1.5%、反應時間40min、反應溫度55℃、循環泵轉速100r/min，該條件下蛋白轉化率為92.75%。

3.3 正交實驗得到最優的酶解工藝條件為:底物濃度4%(W/W)、加酶量1.5%、反應時間30min、反應溫度60℃、循環泵轉速120r/min、pH9.5，該條件下蛋白轉化率為97.56%，比單因素實驗得到的蛋白較優轉化率提高了5.19%。

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表2 L18(37)正交實驗直觀分析表

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Preparation of antioxidant peptides from scale collagen by continuous coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation without material feeding

MA Hai－le1，2，WANG Zhong－bin1，LUO Lin1，2，HE Rong－hai1，2
(1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China;2.Jiangsu Provincial Research Center of Bio－process and Separation Engineering of Agri－products，Zhenjiang 212013，China)

TS201.2+1

B

1002－0306(2010)08－0204－04

2010－05－17

馬海樂(1963－)，教授，博士生導師，研究方向:食品分離及食品生物技術。

863計劃重點項目(2007AA100404);國家十一五支撐計劃(2006BAD27B06)。