酶膜反應(yīng)器連續(xù)酶解花生蛋白的工藝研究

熊治清，徐志宏，*，魏振承，劉 軍，金 晶

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部功能食品重點開放實驗室，廣東廣州510610)

酶膜反應(yīng)器連續(xù)酶解花生蛋白的工藝研究

熊治清1，2，徐志宏1，2，*，魏振承2，劉 軍1，2，金 晶1，2

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部功能食品重點開放實驗室，廣東廣州510610)

以花生蛋白為原料，Alcalase堿性蛋白酶為水解酶，研究了利用酶膜反應(yīng)器連續(xù)酶解花生蛋白的最佳工藝條件。通過單因素實驗選取實驗因素與水平，并確定了操作壓力為0.02MPa。再選取水解度(DH)為響應(yīng)值，設(shè)計了四因素(pH、溫度、底物濃度和加酶量)三水平的中心組合響應(yīng)面實驗。得出最佳工藝條件為:pH9.6，溫度54℃，底物濃度2%，加酶量7440u/g。通過在最佳水解條件下進(jìn)行水解，實際得到DH為26.13%。

酶膜反應(yīng)器，花生蛋白，酶解，響應(yīng)面

Abstract:Peanut protein was hydrolyzed by Alcalase protease in the enzyme membrane reactor.The conditions of the enzymatic reaction were determined and optimized.Through single-factor tests，test factors and the level of test factors was selected，the operating pressure of 0.02MPa was also determined.Subsequently，using hydrolysis degree as response index，the four factors(pH，temperature，substrate concentration and protease dosage)and three levels response surface methodology(RSM)test were designed.It was found that the optimum condition was pH9.6，temperature 54℃，substrate concentration 2%and protease dosage 7440u/g.Under the optimum condition，practical DH was 26.13%.

Key words:enzyme membrane reactor;peanut protein;enzymatic hydrolysis;RSM

花生是我國的六大油料作物之一，資源豐富。在我國花生除直接食用和出口外，主要用于榨油，但榨油后的花生粕未能充分地利用。花生粕中含有50%左右的蛋白，是一種很好的植物蛋白資源［1］。目前國內(nèi)市場上有花生蛋白粉產(chǎn)品，主要是冷榨花生粕直接粉碎的粗產(chǎn)品，蛋白含量為50%～60%，一般作為食品加工的基礎(chǔ)原料［2］。研究發(fā)現(xiàn)，花生蛋白進(jìn)行酶解后產(chǎn)生的生物活性肽具有多種功能活性，如降血壓，抗氧化等，其相對分子量大多分布在3000Da以下，所以本實驗將采用截留相對分子量為3000Da的聚砜膜。同時研究還發(fā)現(xiàn)，通過對各種蛋白酶的選擇，發(fā)現(xiàn)Alcalase堿性蛋白酶對于花生蛋白的水解優(yōu)于其它種類蛋白酶，并且產(chǎn)生的生物活性肽的功能活性也優(yōu)于其它蛋白酶水解產(chǎn)生的［3-7］，所以本文選用Alcalase堿性蛋白酶來水解花生蛋白。目前水解蛋白普遍采用間歇酶解工藝，存在酶不能重復(fù)使用、生產(chǎn)成本高、反應(yīng)時間長、生產(chǎn)效率低及每批次產(chǎn)品質(zhì)量難控制等問題，而酶膜反應(yīng)器可以很好地解決這些問題。酶膜反應(yīng)器(enzyme membrane reactor，EMR)是將酶催化反應(yīng)和膜分離耦合在一起的裝置，集反應(yīng)、產(chǎn)品分離和酶回收再利用于一體，它是在膜反應(yīng)器上改進(jìn)而成的。當(dāng)前國內(nèi)外有關(guān)利用酶膜反應(yīng)器酶解蛋白的研究不是很多，主要集中在牛乳蛋白的酶解上［8-11］，而酶解花生蛋白的研究未曾見報道。本實驗通過利用先進(jìn)的酶膜反應(yīng)器設(shè)備酶解花生蛋白，探討最佳的酶解工藝條件。從而為能在工業(yè)上的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生蛋白粉 蛋白質(zhì)55.8%，水分5.8%，脂肪1.5%，灰分4.8%，市場購買;Alcalase堿性蛋白酶食品級，酶活力1.6×105，丹麥NOVO公司;其他試劑均為分析純。

KDN-08A定氮儀 上海新嘉電子有限公司;FreeZone 7948030冷凍干燥機(jī) 美國LABCONCO公司;pHS-25精密pH計 上海虹益儀器儀表有限公司;TDL-5離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-1恒溫水浴鍋 常州奧華儀器有限公司;JB300-D型強(qiáng)力電動攪拌機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;KF-1中空纖維超濾機(jī)和超濾膜 廣州潔圣膜技術(shù)有限公司，膜材料為聚砜膜，膜面積為0.5m2，截留分子量為3000Da，操作溫度:5～90℃。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生蛋白的制備［12］花生蛋白粉→溶解(料水比1∶10)→堿溶(55℃，加2mol/L NaOH 調(diào)到 pH9.5浸提2h)→離心(3000r/min，10min)→收集上清液→酸沉(加2mol/L HCl調(diào)pH4.5)→離心(3000r/min，15min)→下層沉淀→冷凍干燥→花生蛋白(蛋白含量87.3%)

1.2.2 花生蛋白連續(xù)酶解工藝流程 稱取一定量的花生蛋白溶于適量水中，配制成1L一定濃度的花生蛋白液，放在恒溫水浴鍋中達(dá)到反應(yīng)溫度，然后調(diào)節(jié)pH為設(shè)定值，加入一定單位的Alcalase堿性蛋白酶，先在反應(yīng)器中進(jìn)行酶解1.5h，并滴加 2mol/L的NaOH溶液維持反應(yīng)體系pH恒定，記錄滴加的體積。再開啟超濾裝置使水解液經(jīng)泵流入超濾裝置中，壓力控制在0.02MPa，用量筒接收透過液，截留液回流至反應(yīng)器，同時滴加2mol/L的NaOH溶液維持反應(yīng)體系pH恒定，記錄滴加的體積。在連續(xù)酶解過程中，透過液每達(dá)到50mL時，添加50mL已調(diào)節(jié)到相應(yīng)pH的一定濃度的花生蛋白液至反應(yīng)器中，以維持反應(yīng)體系的體積和底物濃度近似保持恒定，連續(xù)酶解3h后結(jié)束反應(yīng)，最后清洗超濾機(jī)。圖1為酶膜反應(yīng)器連續(xù)酶解花生蛋白的工藝流程圖。

圖1 酶膜反應(yīng)器連續(xù)酶解花生蛋白的工藝流程圖

1.2.3 響應(yīng)面實驗設(shè)計 本實驗采用Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取pH，溫度，底物濃度和加酶量這4個因素進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計。實驗因素水平見表1。

1.2.4 測定方法 水解度的測定:pH-Stat法。

式中:DH為水解度(%);B為水解過程中所消耗的堿量(mL);Nb為堿液的濃度(mol/L);Mp為水解液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g);a為a-氨基的平均解離度;htot為未水解時單位質(zhì)量蛋白質(zhì)所含肽鍵的總數(shù)(mmol/g)，對花生蛋白而言，htot=7.13mmol/g［2］。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 pH對水解度的影響 在底物濃度為2%，反應(yīng)溫度控制在55℃，加酶量為3700u/g，反應(yīng)操作壓力為0.02MPa條件下，分別取不同的反應(yīng)pH為7、8、9、10、11，按照花生蛋白連續(xù)酶解工藝流程進(jìn)行酶解，結(jié)果見圖2。

圖2 pH與水解度的關(guān)系

由圖2可知，水解度隨著pH的升高而增大，當(dāng)pH為10時，水解度達(dá)到最大，pH繼續(xù)升高時水解度迅速下降。因此確定最適pH在10附近。

2.1.2 溫度對水解度的影響 在底物濃度為2%，反應(yīng)pH為8，加酶量為3700u/g，反應(yīng)操作壓力為0.02MPa條件下，分別取不同的反應(yīng)溫度為40、45、50、55、60℃，按照花生蛋白連續(xù)酶解工藝流程進(jìn)行酶解，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度與水解度的關(guān)系

分析圖3可以得出，水解度隨著溫度的升高而迅速增大，當(dāng)溫度為55℃時，水解度達(dá)到最大，溫度繼續(xù)升高時水解度開始下降。因此確定最適溫度在55℃附近。

2.1.3 底物濃度對水解度的影響 在pH為8，反應(yīng)溫度控制在55℃，加酶量為3700u/g，反應(yīng)操作壓力為0.02MPa條件下，分別取不同的底物濃度為1%、2%、2.5%、3%、4%，按照花生蛋白連續(xù)酶解工藝流程進(jìn)行酶解，結(jié)果見圖4。

由圖4得出，在底物濃度為2%時，水解度最大，若底物濃度繼續(xù)增大，水解度開始緩慢下降。因此確定最適底物濃度在2%附近。

圖4 底物濃度與水解度的關(guān)系

2.1.4 加酶量對水解度的影響 在反應(yīng)溫度為55℃，pH為8，底物濃度為2%，反應(yīng)操作壓力為0.02MPa條件下，分別取不同的加酶量為1700、3700、5700、7700、9700u/g，按照花生蛋白連續(xù)酶解工藝流程進(jìn)行酶解，結(jié)果見圖5。

圖5 加酶量與水解度的關(guān)系

由圖5可知，起始時水解度隨著加酶量的增大而迅速增大，但加酶量達(dá)到7700u/g時，加酶量繼續(xù)增加，而水解度變化不大。

2.1.5 操作壓力對水解度的影響 在底物濃度為2%，反應(yīng) pH為8，加酶量為3700u/g，反應(yīng)溫度為55℃條件下，分別取不同的操作壓力為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05MPa，按照花生蛋白連續(xù)酶解工藝流程進(jìn)行酶解，結(jié)果見圖6。

圖6 操作壓力與水解度的關(guān)系

從圖6中可以發(fā)現(xiàn)，水解度隨著操作壓力的增大而減小，特別是當(dāng)操作壓力大于0.02MPa時，水解度迅速減小。可能是由于操作壓力的增大，有些分子量大于截留分子量3000Da的多肽通過膜流出，從而失去了進(jìn)一步被酶解的可能，所以造成水解度下降。通過綜合考慮操作壓力對透過液流速和水解度的影響，確定操作壓力為0.02MPa。

2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，共有27個實驗點，其中24個為析因子，3個為零點。零點實驗進(jìn)行3次，以估計誤差。以水解度為響應(yīng)值，實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.2.1 回歸分析及顯著性檢驗 運(yùn)用SAS8.1軟件對表2中27個實驗點的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為:

DH(%)=25.36333-2.305X1-2.395X2-0.114167X3+1.940833X4-3.114583X1X1-2.2325X1X2-0.4075X1X3-0.83X1X4-3.207083X2X2-0.87X2X3-0.0025X2X4-1.955833X3X3-0.095X3X4-1.303333X4X4

從表3可以看出，以水解度為響應(yīng)值的回歸方程的一次項和二次項是極其顯著的，交互項不顯著，說明回歸方程為非線性回歸，交互項對方程的影響遠(yuǎn)小于一次項和二次項。同時可知總回歸模型達(dá)到(p=0.0013)極顯著水平，說明回歸方程與實際情況吻合得很好。復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.8819，說明模型能解釋DH變化的88.19%。

2.2.2 各因素對水解度的方差分析 由表4可知，pH(X1)，溫度(X2)和加酶量(X4)對于水解度DH有極顯著的影響水平(Pr＜0.01)，而底物濃度(X3)不顯著(Pr＞0.05)。此外，pH和溫度的交互作用也有顯著作用。由F值可知，F(xiàn)值越大對花生蛋白水解度影響就越大，所以各因素對花生蛋白水解度的影響次序:溫度＞pH＞加酶量＞底物濃度。

2.2.3 水解條件pH和溫度交互作用對水解度響應(yīng)面分析 從圖7可知，開始時DH隨pH(X1)、溫度(X2)的增加而增加，當(dāng)pH和溫度變化到一定程度時，DH達(dá)到最大，所以pH和溫度取適中時DH獲得最大值。等勢線圖還表明:X1和X2的作用為互補(bǔ)作用，即適當(dāng)降低溫度和提高pH或者適當(dāng)提高溫度和降低pH都能獲得相同的肽得率［13］。

表3 回歸方程的方差分析

表4 方差分析表

圖7 pH(X1)和溫度(X2)交互作用對水解度DH和等勢線響應(yīng)面分析

2.2.4 花生蛋白酶水解工藝參數(shù)的優(yōu)化及驗證 采用SAS的RESREG程序分析得到最佳工藝參數(shù)為:X1=-0.4，X2=-0.24，X3=0，X4=0.87，即，pH 為 9.6，溫度為54℃，底物濃度為2%，加酶量為7440u/g。在以上條件下，同時控制操作壓力為0.02MPa，此時理論DH達(dá)到26.96%。

在最佳工藝條件下，進(jìn)行了3次驗證實驗，得到花生蛋白水解度DH的平均值為26.13%，而理論值為26.96%，二者的相對誤差為3.08% ＜5%，說明回歸模型擬合性較好。

3 結(jié)論

本實驗選用Alcalase堿性蛋白酶為水解酶，采用酶膜反應(yīng)器連續(xù)酶解花生蛋白。通過單因素實驗得出操作壓力應(yīng)控制在0.02MPa。再利用 Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計和SAS軟件進(jìn)行回歸和響應(yīng)面分析，得出水解度和各種影響因素的回歸模型。同時還得到各因素對水解度的影響次序:溫度＞pH＞加酶量＞底物濃度，最佳工藝參數(shù)為:pH為9.6，溫度為 54℃，底物濃度為 2%，加酶量為7440u/g，操作壓力為0.02MPa。在此條件下，花生蛋白水解度實際達(dá)到26.13%。

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Study on the technology of continuously hydrolyze peanut protein in the enzyme membrane reactor

XIONG Zhi-qing1，2，XU Zhi-hong1，2，*，WEI Zhen-cheng2，LIU Jun1，2，JIN Jing1，2
(1.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China;2.Key Laboratory of Functional Food，Ministry of Agricultual，Biotechnology Institute of Guangdong Academy of Agricultural Science，Guangzhou 510610，China)

TS201.2+1

B

1002-0306(2010)08-0208-05

2009-08-12 *通訊聯(lián)系人

熊治清(1984-)，男，碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工。

國家星火計劃項目(2006EA780029);廣東省科技計劃項目(0711224900012)。