響應面法優化酪蛋白磷酸肽生產工藝研究

邵孟秋，李祖賜，卜爾紅，楊芳芳

(1.岳陽職業技術學院，湖南岳陽414000;2.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128)

響應面法優化酪蛋白磷酸肽生產工藝研究

邵孟秋1，李祖賜1，卜爾紅2，楊芳芳2

(1.岳陽職業技術學院，湖南岳陽414000;2.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128)

在單因素實驗的基礎上，根據Box－Behnken的中心組合實驗設計原理，采用3因素3水平的響應曲面分析法，建立了胰蛋白酶水解酪蛋白制備酪蛋白磷酸肽的二次多項數學模型，并以水解度為響應值作響應面和等高線，得到酶水解酪蛋白制備酪蛋白磷酸肽的優化工藝條件為:水解時間為6h+12min、酶底比為2.23‰、溫度50℃，底物濃度為4%、pH8.4、旋轉振蕩速度120r/min，在此條件下實際水解度為62.04%。

酪蛋白，胰蛋白酶，響應面優化，酪蛋白磷酸肽

Abstract:By single factor experiment，the proper hydrolysis time，temperature，substrate concentration and enzyme－ substrate ratio were determined.The quadratic function mathematics model，for the processing of CPP from trypsin hydrolyzed casein was built.According to the Box－Behnken design principles，by three factors of exercise at three levels response surface methodology，with the Minitab14 statistics analysis software.By analyzing the response surface and contour based on the degree of hysrolysis as response value，the optimal processing was obtained as follows:hydrolysis time 6h+12min，substrate concentration and enzyme－substrate ratio 2.23‰，temperature 50℃，substrate concentration 4%，pH 8.4，with 120r/min，and the actual degree of hysrolysis was 62.04%.

Key words:casein protein;trypsin;response surface optimization;casein phosphopeptides

早在上世紀50年代在國外就開始了對酪蛋白磷酸肽(CPP)的研究，80年代后期CPP的性質和作用機理日趨明朗化。酪蛋白磷酸肽是以牛奶酪蛋白為原料，經過蛋白酶水解，再分離純化之后得到的含有磷酸絲氨?；碾?，具有促進鈣質、鐵和鋅等微量元素的吸收與利用，抗氧化，促進益生菌增殖等作用［1－5］。CPP的核心部位由三個磷酸絲氨酸殘基組成一個－Ser(P)－殘基簇，后面緊接著兩個Glu－殘基。由于牛乳酪蛋白存在四種不同的蛋白質結構，因此不同結構的酪蛋白水解得到的CPP的結構也有所差別，CPP主要有兩種，分別是來自 αs1－酪蛋白的α－CPP和β－酪蛋白的β－CPP。此外，用胰蛋白酶水解β－酪蛋白得到的1～18氨基酸殘基組成的肽段和105～107氨基酸殘基組成的肽段能夠刺激BA LB/c3T3細胞合成DNA，并促進了細胞的增殖。用胰蛋白酶水解αs1酪蛋白得到的1～23氨基酸殘基組成的肽段具有抗菌的作用［6］。酪蛋白磷酸肽(CPP)作為一種活性多肽，由于其穩定性好、有多種生物活性，因此具有相當大的開發應用潛力［7－8］。并且由于制造CPP的原料即酪蛋白是天然蛋白質，所以CPP的應用不存在安全性問題［9］;CPP作為一種功能性原料，在日本、德國等已開發出添加CPP的保健食品;有些國家已將CPP作為添加劑應用于飼料工業中［10］?？捎糜谏aCPP的酶類很多，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶和堿性蛋白酶，多來源于動物、植物和微生物。胰蛋白酶和胰酶來源于動物胰臟，胰蛋白酶專一性強，但其本身很容易自水解，且價格較高，目前主要用于酪蛋白水解特性的研究。從動物的胰臟中提取出來的胰酶是由胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、脂肪酶和淀粉酶等構成的混合酶體系，來源豐富，價格較低。胰酶中的兩種主要成分是胰蛋白酶和糜蛋白酶，它們都可以保證產品中CPP活性基團的完整性，而且由于多酶催化，不僅可以加快水解速度，還可以得到更短的肽段［11］。目前歐洲、日本生產CPP絕大多數采用的是胰蛋白酶法［12－13］。本文擬利用響應面分析方法對胰蛋白酶水解酪蛋白制備酪蛋白磷酸肽工藝進行優化，獲得最優的工藝參數，有效減少工藝操作的盲目性，從而為進一步對其功能性進行研究奠定基礎。

1 材料與設備

1.1 材料與儀器

酪蛋白、胰蛋白酶、三氯乙酸、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、硼砂、NaOH、高氯酸－硝酸、硫酸、鹽酸、無水乙醇、無水氯化鈣 國藥化學試劑有限公司。

AB－L型分析天平 梅特勒－托利多中國;7200型分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;TG16－WS(1650D)高速離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋 金壇市岸頭國瑞實驗儀器廠;電熱鼓風干燥箱 上海賽歐實驗設備有限公司;微量凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司;PHB－4型pH計 上海精密儀器儀表有限公司;FD－1C真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;R－201旋轉蒸發器 上海盛玻儀器有限公司;G－506E旋渦混勻器 Scientific Industries，Inc。

1.2 實驗方法

1.2.1 酪蛋白磷酸肽制備工藝 酪蛋白→胰蛋白酶水解→酶滅活→調節pH至4.6→離心→取上清液(加乙醇－鈣)→離心→沉淀→冷凍干燥→成品

操作要點:將酪蛋白溶于堿液中，加熱不斷攪拌，調好pH;配好一定濃度的酶液加入到完全溶解的酪蛋白溶液中;酶水解液置于90℃水中10min;調節酶解液pH至等電點4.6，使未水解酪蛋白沉淀;4000r/min離心15min;取上清液加入2%氯化鈣，95%無水乙醇;5000r/min離心10min;白色沉淀物至冷凍干燥機中干燥24h。

1.2.2 水解度的測定 水解度是指酪蛋白酶解過程中斷裂的肽鍵占全部肽鍵的百分數。

水解度的測定參考三氯乙酸沉淀法。取出5mL酶解液以1∶1比例取三氯乙酸沉淀樣品水解液中的大分子蛋白質，經4000r/min離心15min過濾后，在上清液中加入20mL雙縮脲試劑，于540nm測定其OD值，對照標準曲線(圖1)求得樣品溶液中的多肽濃度C(mg/mL)，進而可求得樣品中多肽含量。

標準曲線公式:

X=(Y－0.0068)/0.0429

式中:X為多肽的濃度，mg/mL;Y為吸光度

酪蛋白的水解度按下式計算:

水解度DH(%)=(X×100)/(Z×100%)/1000×100

式中:X為多肽的濃度，mg/mL;Z為底物含量，mg。

圖1 雙縮脲測定法標準曲線圖

1.2.3 總氮的測定 按GB/T5009.5－2003食品中蛋白質的測定方法執行。

1.2.4 總磷的測定 總磷量的測定參考鉬藍比色法(GB/T5009.87－2003)，略加改進。

稱取樣品0.5g于100mL凱氏燒瓶中，加入3mL硫酸，3mL高氯酸－硝酸消化液，置于消化爐上。瓶中液體初為棕黑色，待溶液變成無色或微帶黃色清亮液體時，即消化完全。將溶液放冷，加20mL水，趕酸，冷卻，轉移至100mL容量瓶中，用水多次洗滌凱氏燒瓶，洗液合并倒入容量瓶中，加水至刻度，混勻。此溶液為試樣測定液。

準確吸取試樣測定液2mL及同量的空白溶液，分別置于20mL具塞試管中，依次加入2mL鉬酸溶液，搖勻，靜置幾秒鐘，加入1mL亞硫酸鈉溶液，1mL對苯二酚溶液，搖勻，加水至刻度，混勻，靜置0.5h以后，在分光光度計660nm波長處測定吸光度，以測出的吸光度在標準曲線上查得試樣液中的磷含量。

1.2.5 氮/磷摩爾比的測定

1.2.6 酶解工藝參數選擇實驗

1.2.6.1 不同水解時間對酪蛋白水解度的影響 在pH8.4，50℃，底物濃度為4%，酶的添加量為2.0‰時，測定不同水解時間對酪蛋白水解度的影響。

1.2.6.2 不同水解溫度對酪蛋白水解度的影響 在時間為6h，E/S為2.0‰，底物濃度為4%，pH8.4時，測定不同水解溫度對酪蛋白水解度的影響。

1.2.6.3 不同底物濃度對酪蛋白水解度的影響 在時間為6h，E/S為2.0‰，pH8.4，溫度50℃時，測定不同底物濃度對酪蛋白水解度的影響。

1.2.6.4 不同酶底比對酪蛋白水解度的影響 在pH8.4，50℃，底物濃度為4%，時間為6h時，測定不同酶底比對酪蛋白水解度的影響。

2 結果與討論

2.1 不同水解時間對酪蛋白水解度的影響

從圖2可以得出，酪蛋白的水解度隨酶解時間的延長而增加。當反應時間在4～6h時，水解度增長較快，水解度與時間呈線性關系;當水解時間在7～10h時，水解度隨時間增加的幅度趨于平緩;在水解6h時，酪蛋白水解度達到最大，為60.51%。究其原因，主要是隨著酶解反應的進行:底物濃度減少，反應位點逐漸被酶分子飽和，可與酶作用的肽鍵數量減少;產物濃度增加，其競爭性抑制增強;酶活性逐漸降低。因此，實驗選取6h為最佳水解時間。

圖2 不同時間對酶水解的影響

2.2 不同水解溫度對酪蛋白水解度的影響

從圖3可以看出，在35℃時，酪蛋白水解度較小;然后隨溫度的升高，酶水解速度逐漸加快，50℃時水解度達到最大值，其水解度為61.79%。當溫度高于50℃時，隨著溫度的升高，酪蛋白的水解度逐漸下降。

圖3 不同溫度對酶水解的影響

溫度對酪蛋白水解反應速度的影響分析如下:在低溫段酶活力較小，酶水解速度較低;在適宜溫度下，有利于酪蛋白折疊結構的舒展(解聚)，肽鍵更易與酶結合，酶水解速度加快;隨著溫度繼續升高，酶蛋白變性失活，酶水解速度降低。因此，實驗確定最佳酪蛋白水解溫度為50℃。

2.3 不同底物濃度對酪蛋白水解度的影響

由圖4看出，底物濃度由2%增加到8%時，水解度呈逐漸降低的趨勢，這是因為酪蛋白分子可以在水溶液中聚合形成分子量為10萬以上的大分子，這些大分子阻礙胰酶對切割位點的作用，從而降低了反應的水解度。而且隨著底物濃度的提高，當超過飽和狀態時，抑制作用就會越來越嚴重，表現為水解度值明顯降低，底物濃度升至8%，最終水解度降為35%。雖然底物濃度越低，水解度越高，但是絕對產物得率卻不一定高，所以底物濃度也存在一個最佳值。

圖4 不同底物濃度對酶水解的影響

2.4 不同酶底比對酪蛋白水解度的影響

從圖5可以看出，當酶底比為0.5‰時，隨著酶底比增大，酪蛋白的水解度逐漸增大，當酶底比大于2.0‰時，酪蛋白的水解度不再隨酶底比的增大而增大。這是因為當酶底比較低時，底物過量，酶與底物完全結合，水解程度增大;當酶底比較高時，蛋白質濃度相對較小，有一部分酶分子沒有機會與蛋白質結合，所以水解程度變化不大，由此可以確定最適酶底比為2.0‰。

圖5 不同酶底比對酶水解的影響

2.5 響應曲面法實驗結果

根據Box－Behnken響應曲面設計的中心組合實驗設計原理，結合以上實驗結果，運用Minitab14數據統計分析軟件，選取水解時間、酶底比、溫度3個影響因子，各取3個水平，采用3因素3水平的響應曲面分析方法，對水解條件進行優化設計。實驗因素與水平設計見表1，共15個實驗點，其中12個為析因點，3個為零點，零點實驗進行了3次，以估計誤差。

表1 3因素3水平響應面分析實驗設計表

響應曲面法的實驗設計及結果見表2。運用Minitab14數據統計分析軟件使用未編碼單位對實驗數據進行多元回歸擬合，設時間、酶底比、溫度分別為X1、X2、X3，回歸模型系數及顯著性檢驗結果見表3，回歸模型的方差分析表見表4。

表2 響應面優化制備CPP工藝實驗設計與結果

回歸模型方差分析表表明回歸模型是顯著的(P=0.001)，回歸模型系數的顯著性檢驗結果R－Sq(殘差的平方)=96.62%，對于加工過程中數據，96.62%的變異可由該模型解釋。方差分析表中失擬P值為0.709，大于0.05，因此證明該模型可以充分地解釋響應中的變異，模型擬合度很高。

表3 回歸模型系數及顯著性檢驗結果

表4 回歸模型的方差分析表

在該模型中，回歸進一步分解為不同階的項:線性、平方和交互作用。平方響應的P=0.001小于0.05，因此具有顯著的二次效應。觀察回歸模型系數顯著性檢驗結果，其中項的P值均小于0.01，也就是說時間、酶底比、溫度對水解度均具有顯著的二次效應，它們與水解度之間的關系符合曲線規律。

觀察表3中，各系數的 P值，發現 X1X2、X1X3、X2X3的P值均大于0.05，說明時間、酶底比、溫度之間的相互作用對水解度的影響不大，這與方差分析表中交互作用檢驗結果一致，方差分析表中交互作用的P值為0.184大于0.05，交互作用不顯著。

綜合上述分析結果，去除模型中不顯著的項，得到時間(X1)、酶底比(X2)、溫度(X3)的二次多項回歸模型:

2.6 水解條件的響應曲面分析與優化

模型(1)的響應曲面見圖6～圖8，3組圖直觀地反映了各因素對響應值的影響。由圖6可知，水解時間保持在6h時，水解度隨著溫度的提高而增加。溫度在50℃左右時水解度達到最高，隨著溫度的繼續升高又開始降低。由圖7可知，酶底比保持在2.0‰時，水解度隨時間延長顯著增加，溫度從45℃開始水解度呈逐步上升的趨勢，到50℃時水解度達到最大。由圖8可以看出，酶底比從1‰開始隨著時間的延長水解度逐步升高，當酶底比為2‰，時間為6h時水解度達到最大。

運用Minitab軟件的響應優化器對實驗結果進行優化，得到模型的最優解:水解時間為6.22h、酶底比為2.23‰、溫度50.25℃，預測的水解度為62.88%。

為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化條件進行酶水解酪蛋白制備酪蛋白磷酸肽重復實驗，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數修正為:水解時間為6h+12min、酶底比為2.23‰、溫度50℃，底物濃度為 4%、pH8.4、旋轉振蕩速度120r/min，在此條件下實際水解度為62.04%，與理論預測值相比，其相對誤差約為1.34%。因此，基于響應曲面法所得的優化工藝參數準確可靠，具有實用價值。

圖6 水解過程中溫度、時間及其交互作用對水解度影響的響應曲面圖

圖7 水解過程中酶底比、溫度及其交互作用對水解度影響的響應曲面圖

圖8 水解過程中酶底比、時間及其交互作用對水解度影響的響應曲面圖

3 結論

3.1 基于實驗設計軟件Minitab14，通過二次回歸設計得到了胰蛋白酶水解酪蛋白制備酪蛋白磷酸肽過程中水解度與水解時間、底物濃度、酶底比的回歸模型，經檢驗證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預測水解度。

3.2 利用模型的響應面及其等高線，在pH8.4，溫度50℃情況下對影響水解度的關鍵因素及其相互作用進行探討，得到的優化工藝參數為:水解時間為6.22h、酶底比為2.23‰、溫度50.25℃，考慮到操作的便利，水解時間為6h+12min、酶底比為2.23‰、溫度50℃，底物濃度為4%、pH8.4、旋轉振蕩速度120r/min，在此條件下實際水解度為62.04%。

3.3 利用響應面分析方法對胰蛋白酶水解酪蛋白制備酪蛋白磷酸肽工藝進行優化，可獲得最優的工藝參數，能有效減少工藝操作的盲目性，從而為進一步的實驗研究奠定基礎。

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Optimum of casein phosphopeptides production process by using response surface methodology

SHAO Meng－qiu1，LI Zu－ci1，BU Er－hong2，YANG Fang－fang2
(1.Yueyang Vocational and Technical College，Yueyang 414000，China;2.The Food Science and Technology，Hunan Agriculture University，Changsha 410128，China)

TS201.2+1

B

1002－0306(2010)08－0225－05

2009－09－17

邵孟秋(1967－)，男，碩士，講師，研究方向:食品生物技術。