從猴頭菇中提取純化SOD

張 帥，鄭少麗，董 基

(肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東肇慶526061)

從猴頭菇中提取純化SOD

張 帥，鄭少麗，董 基

(肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東肇慶526061)

研究了從猴頭菇中提取并純化SOD的方法和最佳條件。采用乙醇－氯仿法通過均勻?qū)嶒?yàn)獲得最佳提取條件為1g猴頭菇加入到0.15mol·L－1的NaHCO35mL中，加入乙醇－氯仿(2∶1，v/v)溶液6mL，在30℃下提取3.5h測得粗酶液活性為321.26U。采用丙酮二級純化法，純化所得SOD的酶比活為95.58U·mg－1。

猴頭菇，超氧化物歧化酶，提取，純化

Abstract:The methods and the best conditions of extraction and purification of SOD from hericium erinaceus were researched.The best extraction conditions were obtained by method of ethanol－chloroform with uniform experiment，1g hericium erinaceus was put into 5mL 0.15mol·L－1NaHCO3solution，ethanol－chloroform(2∶1，v/v)was 6mL，extracting 3.5h at the temperature of 30℃，crude enzyme activity of SOD was 321.26U.Specific enzyme activity of SOD purified by method of acetone secondary purification was 95.58U·mg－1.

Key words:Hericium Erinaceus;SOD;extraction;purification

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)，是一種催化超氧化物陰離子自由基發(fā)生歧化，生成氧和過氧化氫，從而清除超氧化物陰離子自由基并含有不同金屬離子的氧化還原酶。該酶最早于1938年Mann和Keilin在進(jìn)行牛血紅細(xì)胞的分級分離時(shí)，從牛紅細(xì)胞中分離出一種藍(lán)色的含銅蛋白質(zhì)，命名為血球銅蛋白(Erythrocuprein)，但其生理機(jī)能并未研究清楚。到1969年才由McCord和Fridovich發(fā)現(xiàn)該蛋白具有生物酶活性，能催化超氧陰離子進(jìn)行歧化反應(yīng)，從而命名為超氧化物歧化酶［1］。此后許多學(xué)者利用豬血、獼猴桃果實(shí)、各種蔬菜及微生物等提取SOD。由于SOD能催化超氧自由基歧化為過氧化氫和分子氧，對人體的超氧負(fù)離子自由基(Superoxide anionnadical，·)的氧化性損傷發(fā)揮著有效的清除作用和生理效用，因此對機(jī)體的防護(hù)和抗衰老、抗炎癥、抗腫瘤、抗自身免疫性疾病、抗輻射及抗休克等均有積極作用，受到醫(yī)藥界和生化界的高度重視，同時(shí)還被應(yīng)用到化妝品、保健食品及食品添加劑等領(lǐng)域中，且隨著研究的深入，其應(yīng)用范圍仍在不斷擴(kuò)大［2］。猴頭菇SOD活性較強(qiáng)，但關(guān)于猴頭菇SOD的報(bào)道較少，本文主要研究了從猴頭菇中提取和純化超氧化物歧化酶的方法，為食用菌SOD的提取純化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇(干樣，粉碎) 市購;甲苯、氯仿、無水乙醇、異丙醇、正丁醇、丙酮、EDTA、磷酸鉀緩沖液(分別為pH7.0、7.8、8.3)、鄰苯三酚、鹽酸、硫酸銨等 均為分析純。

UV/VIS 916紫外可見分光光度計(jì) 澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司;800型低速離心機(jī) 中國深圳;溫水浴鍋8302型 余姚金電儀表有限公司;BS210S電子分析天平 北京賽多利斯。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制方法

1.2.1.1 50mmol·L－1K2HPO4－KH2PO4(pH8.3) 緩沖液1mol·L－1的 K2HPO4溶液 96.5mL 與 1mol·L－1的KH2PO4溶液3.5mL混合搖勻后，定容至2000mL。

1.2.1.2 50mmol·L－1磷酸緩沖液 (pH7.8，含1mmol·L－1EDTA)1mol·L－1的 Na2HPO4溶液89.6mL 與 1mol·L－1的 NaH2PO4溶液 10.4mL 混合后，加入0.744g EDTA，混勻后定，容至2000mL。

1.2.1.3 50mmol·L－1磷酸鉀緩沖液(pH7.0)1mol·L－1的K2HPO4溶液61.5mL 與1mol·L－1的 KH2PO4溶液38.5mL混勻后，定容至2000mL。

1.2.1.4 50mmol·L－1鄰苯三酚溶液 稱取鄰苯三酚3.15g，用0.01mol·L－1HCl溶液溶解，定容至500mL。

1.2.2 提取方法［3－7］

1.2.2.1 甲苯法 每克干猴頭菇加入3mL甲苯，35℃破壁45min后加入50mmol·L－1磷酸緩沖液(pH7.8，含 1mmol·L－1EDTA)2mL，于室溫下提取 5h，以4000r/min離心 30min，收集上清液即為 SOD粗提液。

1.2.2.2 乙醇－氯仿法 每克干猴頭菇加入8mL 0.2mol·L－1的 NaHCO3溶液，加入 6mL 乙醇－氯仿(5∶3，v/v)溶液，攪拌 2h，以 4000r/min 離心 30min，收集上清液即為SOD粗提液。

1.2.2.3 異丙醇法 每克干猴頭菇加入9mL異丙醇，浸泡 120min，抽濾除去溶液，加入 3倍體積的50mmol·L－1磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，攪拌 120min，4000r/min離心30min除去菌體，即得SOD粗提液。

1.2.3 SOD活性測定 鄰苯三酚自氧化法［8－10］。

1.2.3.1 測定原理 堿性條件下，鄰苯三酚會發(fā)生自氧化生成紅桔粉，同時(shí)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，鄰苯三酚的自氧化速率與·的濃度有關(guān)。SOD能催化O2－·發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2和O2，從而抑制鄰苯三酚自氧化。樣品對鄰苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映樣品中SOD的含量。

酶活單位定義:規(guī)定條件下，1mL反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚在325nm波長下的自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。

式中，A0:每分鐘鄰苯三酚自氧化速率的吸光度，OD/min;A1:加入SOD后每分鐘鄰苯三酚自氧化速率的吸光度，OD/min;V0:反應(yīng)液總體積，mL;V1:樣液體積，mL;n:樣液稀釋倍數(shù)。

1.2.3.2 酶活測定 a.鄰苯三酚自氧化速率的測定在10mL比色管中加入 pH8.3的 50mmol·L－1的K2HPO4－KH2PO4緩沖液4.5mL，在25 ±0.5℃恒溫水浴中保溫20min，然后加入在25±0.5℃恒溫水浴中預(yù)熱好的鄰苯三酚溶液(空白管用10mmol·L－1HCl代替)，迅速搖勻倒入比色皿中，以空白管為參比，在325nm下每隔30s記錄一次吸光值，連續(xù)記錄4min，調(diào)節(jié)鄰苯三酚溶液用量，將其自氧化速率控制在0.07±0.002OD/min。測得鄰苯三酚溶液用量為4μL;b.樣品活性的測定 在10mL比色管中加入pH8.3的 50mmol·L－1K2HPO4－KH2PO4緩沖液4.5mL，在25±0.5℃的恒溫水浴中保溫20min，然后加入在25±0.5℃恒溫水浴中預(yù)熱好的鄰苯三酚溶液4μL(空白管用10mmol·L－1HCl代替)，迅速搖勻倒入比色皿中，以空白管為參比，在325nm下每隔30s測一次吸光值 A1，連續(xù)記錄4min，調(diào)節(jié)樣液體積，使樣液中鄰苯三酚氧化速度控制在0.035±0.002OD/min，記錄此時(shí)樣液體積。

1.2.4 純化方法［11－12］

1.2.4.1 正丁醇－氯仿純化法 用2mol·L－1HCl調(diào)SOD粗提液pH至5.0，加入正丁醇－氯仿溶液(1∶4，v/v)，振蕩均勻后至冰箱冷凍沉淀蛋白，4000r/min離心除去沉淀蛋白。測SOD活性及蛋白含量。將上述粗純化液的上清液用2mol·L－1HCl調(diào)pH至4.0，繼續(xù)加入正丁醇－氯仿溶液(1∶4，v/v)，進(jìn)行二次沉淀，離心收得 SOD純化產(chǎn)品，測 SOD活性及蛋白含量。

1.2.4.2 丙酮純化法 用2mol·L－1HCl調(diào)SOD粗提液pH至5.0，加入丙酮，振蕩均勻后至冰箱冷凍沉淀蛋白，4000r/min離心除去沉淀蛋白。測SOD活性及蛋白含量。將上述粗純化液的上清液用2mol·L－1HCl調(diào)pH至4.0，繼續(xù)加入丙酮，進(jìn)行二次沉淀，離心收得SOD純化產(chǎn)品，測SOD活性及蛋白含量。

1.2.4.3 鹽析法 硫酸銨價(jià)格便宜，溶解度大且受溫度影響小，具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，且可較好地保持SOD活性，常被用于蛋白質(zhì)初級純化和濃縮。用2mol·L－1HCl調(diào)SOD粗提液pH至5.0，取一定體積粗酶液加入55%硫酸銨溶液，振蕩混勻于冰箱中冷凍沉淀，4000r/min離心除去沉淀蛋白。測SOD活性及蛋白含量。調(diào)pH至4.0再進(jìn)行二次沉淀。

1.2.5 蛋白含量的測定［13］通過測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白系列濃度吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)測定從樣品中沉淀出蛋白的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程讀取制備樣品的蛋白濃度c。

式中，c:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程讀取制備樣品的蛋白濃度，mg/mL;v:制備樣品的蛋白的體積，mL;m:樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 破壁提取SOD方法的確定

SOD為胞內(nèi)酶，因此須先破壁，使酶溶解到溶液中。本實(shí)驗(yàn)采用了甲苯法、乙醇－氯仿法、異丙醇法，結(jié)果見表1。

表1 不同破壁法所得SOD粗酶液活力的比較

由表1可知，3種方法中，乙醇－氯仿法的總酶活力比其他兩種方法高。說明乙醇－氯仿法破壁效果較好，對酶破壞率小，酶保存率較高，因此確定乙醇－氯仿法為猴頭菇的破壁提取方法。

2.2 乙醇－氯仿法破壁提取SOD技術(shù)條件的優(yōu)化

采用均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法［14］，對影響乙醇－氯仿法提取SOD的主要因素作了綜合考察，表2為所選因素及其水平，表3為實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析。此實(shí)驗(yàn)經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表2 均勻?qū)嶒?yàn)因素及水平的選擇

從表3可知，極差R大小為RA=RF＞RB=RE＞RC=RD，即在所選因素及其水平范圍內(nèi)，對提取SOD影響最大的因素為NaHCO3加入量和提取溫度，其次為NaHCO3濃度和乙醇與氯仿的比，最后為提取時(shí)間和乙醇－氯仿的量。最優(yōu)水平組合A1B1C3D1E3F3，即NaHCO3加量為5mL，濃度為0.15mol·L－1，提取時(shí)間3.5h，乙醇－氯仿的量 6mL，乙醇∶氯仿(v/v)=2∶1，提取溫度30℃。但最優(yōu)條件搭配是否真正最優(yōu)還需驗(yàn)證。表4是按最優(yōu)條件實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，SOD理論值為342.01U·g－1。可見 1g的 SOD產(chǎn)量平均能達(dá)到317.10U，此值高于均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中SOD產(chǎn)量最高值的第二號實(shí)驗(yàn)(224.36U)，與理論值較接近。

表3 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析

表4 按最優(yōu)條件組合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

2.3 猴頭菇SOD純化方法的確定

在粗酶液中除了含有SOD，還含有其他雜蛋白，因此要純化。在純化工藝中采用正丁醇－氯仿(正丁醇∶氯仿 =1∶4，v/v)、丙酮和硫酸銨三種沉淀劑，根據(jù)SOD與雜蛋白等電點(diǎn)不同的特點(diǎn)進(jìn)行純化。SOD等電點(diǎn)在pH4.0左右，而雜蛋白pH5.0左右時(shí)沉淀量很多，因此純化時(shí)將pH調(diào)到5.0，三種純化方法結(jié)果見表5。此實(shí)驗(yàn)經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表5 三種純化方法SOD酶液活性比的比較

可見，丙酮法純化除雜蛋白后酶活性較高，且沉淀雜蛋白量較多，純化效果較好。因此確定丙酮純化法為猴頭菇SOD純化方法。

2.4 丙酮法純化SOD技術(shù)條件的優(yōu)化

2.4.1 不同濃度丙酮對蛋白質(zhì)沉淀的影響 配制4組丙酮與粗酶液比例分別為 1∶5、2∶5、3∶5、4∶5(v/v)的溶液進(jìn)行純化，測得純化SOD的酶比活，結(jié)果見表6。此實(shí)驗(yàn)經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

可見，在 pH5.0，丙酮∶粗酶液(v/v)=3∶5 時(shí)，雜蛋白沉淀最多，SOD純化后活性相對其他較高，SOD酶比活相對較高，綜合考慮，在該比例下的SOD活性較高，純度也較高。

表6 不同濃度丙酮對蛋白質(zhì)沉淀的影響

2.4.2 不同濃度丙酮對SOD沉淀的影響 將通過離心除去雜蛋白的上清液的pH調(diào)到SOD等電點(diǎn)pI4.0，然后在不同濃度丙酮條件下沉淀SOD，測得SOD酶比活見表7。此實(shí)驗(yàn)經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表7 不同濃度丙酮對SOD沉淀的影響

可見，采用丙酮∶SOD清液(v/v)為7∶10的比例進(jìn)行二級純化所得SOD酶比活最高，SOD純度最高。

2.5 猴頭菇SOD提取純化結(jié)果

取干猴頭菇1g于5mL 0.15mol·L－1NaHCO3溶液中，加入乙醇－氯仿6mL，其中乙醇∶氯仿(v/v)=2∶1，在30℃提取3.5h，離心所得粗酶液采用丙酮法純化，用 2mol·L－1HCl調(diào) pH5.0，在丙酮∶粗酶液(v/v)=3∶5進(jìn)行第一次沉淀除去雜蛋白，再將第一次沉淀的清液用 2mol·L－1HCl調(diào) pH4.0，在丙酮∶SOD清液(v/v)為7∶10下進(jìn)行第二次純化，所得SOD產(chǎn)品結(jié)果見表8。此實(shí)驗(yàn)經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表8 優(yōu)化提取條件下猴頭菇SOD提取純化結(jié)果

可見，采用乙醇－氯仿法提取猴頭菇SOD，再用丙酮純化法進(jìn)行二次沉淀的方法，所得SOD的酶比活可達(dá)95.58U/mg。

3 結(jié)論

3.1 本文研究了從猴頭菇中提取SOD的最佳破壁方法，通過均勻?qū)嶒?yàn)獲得了最佳破壁條件并確定最佳提取條件為:1g猴頭菇中，加入濃度為0.15mol·L－1的NaHCO35mL 和乙醇－氯仿(2∶1，v/v)溶液 6mL，在30℃下提取3.5h，所得粗酶液的酶活力為321.26U。

3.2 采用丙酮法對粗酶液進(jìn)行純化，根據(jù)雜蛋白和SOD等電點(diǎn)不同進(jìn)行二級純化，并得出最優(yōu)純化條件。一次純化最佳條件為丙酮∶粗酶液(v/v)=3∶5，二次純化最佳條件為丙酮∶SOD清液(v/v)=7∶10，經(jīng)過二級純化后的SOD在保持較高活性的前提下取得較高純度，二級純化后酶比活為95.58U/mg。

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Extraction and purification of SOD from Hericiun Erinaceus

ZHANG Shuai，ZHENG Shao－li，DONG Ji
(School of Chemistry and Chemical Engineering，Zhaoqing University，Zhaoqing 526061，China)

TS255.1

B

1002－0306(2010)08－0233－04

2009－07－09

張帥(1978－)，男，講師，研究方向:食品發(fā)酵。