檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)菌種黑曲霉的選育

任曉莉，趙 林，趙潤柱

(1.天津大學環(huán)境科學與工程學院，天津300072;2.太原工業(yè)學院環(huán)境與安全工程系，山西太原030008)

檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)菌種黑曲霉的選育

任曉莉1，2，趙 林1，*，趙潤柱2

(1.天津大學環(huán)境科學與工程學院，天津300072;2.太原工業(yè)學院環(huán)境與安全工程系，山西太原030008)

對檸檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉進行了85℃高溫和亞硝基胍復(fù)合誘變研究，確定了黑曲霉單孢子懸液適宜的誘變條件，溫度為85℃高溫，水浴時間為10min，質(zhì)量濃度為1mg/mL亞硝基胍溶液的處理時間為4min，通過對復(fù)合誘變后的菌株進行平板初篩和搖瓶復(fù)篩，獲得了一株遺傳性能穩(wěn)定的優(yōu)良菌株TN－02，平均產(chǎn)酸率為13.61%，與出發(fā)菌株相比，產(chǎn)酸增幅達到43.20%。

黑曲霉，高溫，亞硝基胍，誘變

Abstract:For the breeding of Aspergillus niger for nitric acid fermentation，the relationship between the survival rate and mutagenic time were researched，the results showed the optimal time for 85℃，mutation bath time was 10 min，and 4min for 1mg/mL NTG mutation.In addition，by using 85℃ and NTG compound mutation，high－yielding and genetic stability strains TN－02 was obtained，acidogenic rate reached 13.61%and raises 43.2%compared to that of the original strain.

Key words:Aspergillus niger;high temperature;NTG;mutation

檸檬酸也稱枸椽酸，廣泛應(yīng)用于香料或作為飲料的酸化劑，在食品和醫(yī)學上用作多價螯合劑，也是一種非常重要的化學中間體。檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)目前所采用的菌種主要是黑曲霉菌種和酵母菌菌種，而淀粉質(zhì)原料發(fā)酵主要以黑曲霉菌種為主，對于檸檬酸發(fā)酵行業(yè)來說，菌種產(chǎn)酸水平的高低是決定檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一，因此，檸檬酸菌種黑曲霉的選育研究一直成為科研人員關(guān)注的焦點，國內(nèi)外有很多關(guān)于檸檬酸發(fā)酵菌種黑曲霉選育的研究報道［1－4］。我國檸檬酸生產(chǎn)菌種的發(fā)酵水平經(jīng)過幾十年的努力，工業(yè)產(chǎn)酸水平平均達到13%以上，盡管我國檸檬酸發(fā)酵技術(shù)在世界上暫時處于領(lǐng)先地位，但菌種選育方面的競爭依然形勢嚴峻［5］，目前對檸檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉菌的選育仍以常規(guī)誘變?yōu)橹鳎^為有效的誘變因子有:UV(紫外線)、激光、Co－射線、γ－射線、NTG(亞硝基胍)、EMS(甲基磺酸乙酯)等［6－9］，為了提高誘變效果，主要以復(fù)合誘變?yōu)橹鳌１菊撐膶Ω邷睾蛠喯趸覐?fù)合誘變檸檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉菌進行了實驗研究，所提供的誘變方法對于獲得檸檬酸生產(chǎn)高產(chǎn)菌株，促進檸檬酸行業(yè)的發(fā)展有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑曲霉(Aspergillus niger) 由實驗室保存，經(jīng)斜面活化篩選后作為出發(fā)菌株和對照菌株;斜面培養(yǎng)基 察氏瓊脂培養(yǎng)基;篩選培養(yǎng)基 察氏瓊脂培養(yǎng)基添加0.04%溴甲酚綠指示劑;搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)基 NH4NO30.28%，K2HPO40.04%，MgSO40.05%，蔗糖15%。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘變方法 將配制好的單孢子懸液用玻璃珠打散后，置于85℃的水浴恒溫鍋中恒溫水浴10min，取水浴后的單孢子懸液分裝無菌試管中并編號，分別加入配制好的丙酮助溶的NTG(亞硝基胍)母液，NTG最終濃度為1.00mg/mL，充分混勻后，經(jīng)35℃、160r/min振蕩處理4min，用Na2S2O3溶液終止反應(yīng)，冷生理鹽水洗滌2～3次，加入5mL無菌水，稀釋成不同梯度濃度涂布篩選平板，35℃培養(yǎng)4～6d。

1.2.2 亞硝基胍誘變時間的確定 在配制好的黑曲霉單孢子懸液中加入NTG母液，使黑曲霉單孢子懸液中NTG的母液濃度為1mg/mL，混勻后放置，測定不同誘變時間下黑曲霉單孢子懸液的存活率。

1.2.3 突變株篩選方法 經(jīng)85℃高溫和NTG誘變后的單孢子懸液涂布平板培養(yǎng)4～6d，用接種環(huán)從篩選平板中挑取變色圈直徑(T)與菌落直徑(J)的比值(R)較大的黑曲霉菌株接種斜面，35℃培養(yǎng)4～6d后，用無菌水沖洗斜面接種到搖瓶培養(yǎng)液中(500mL裝液30mL)，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，溫度調(diào)節(jié)至35℃，搖床轉(zhuǎn)速300r/min，振蕩培養(yǎng)4～6d，進行總酸測定，根據(jù)出發(fā)菌株平均搖瓶產(chǎn)酸水平9.5%，計算誘變后菌株的產(chǎn)酸增幅。

1.2.4 總酸測定 將發(fā)酵液經(jīng)脫脂棉過濾后，用定性濾紙過濾，吸取濾清液10mL，置于250mL錐形瓶中，加蒸餾水100mL，并滴加0.5%的酚酞指示劑兩滴，用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定，記錄所消耗的NaOH的體積為V，計算產(chǎn)酸率。

式(1)中:A是產(chǎn)酸率，%;CNaoH是氫氧化鈉的摩爾濃度，mol/L;M檸是檸檬酸的摩爾質(zhì)量，g/mol;V是所消耗的NaOH的體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫水浴誘變時間的確定

誘變劑量的選擇往往以致死率為依據(jù)，若致死率太高，易產(chǎn)生負突變;若致死率太低，則突變較低，適宜的誘變劑量應(yīng)該選擇在致死率為75%～85%之間，本實驗為了確定85℃的高溫水浴的誘變時間，對高溫水浴的誘變時間和孢子存活率進行了測定，結(jié)果見圖1。

圖1 85℃水浴時間對致死率的影響

由圖1可以看出，在85℃時，黑曲霉孢子存活率隨著水浴時間的延長而降低，由圖1數(shù)據(jù)擬合得到黑曲霉孢子的對數(shù)殘留方程:

方程式(2)與對數(shù)殘留定律基本一致，這說明黑曲霉孢子在85℃時受熱死亡速率基本符合對數(shù)殘留定律，即黑曲霉孢子受熱死亡速率與任何瞬間殘留的活菌數(shù)成正比，

由圖1還可以看出，當85℃高溫水浴時間為10min時，存活率約為20%左右，致死率約在80%左右，此時的誘變時間認為是適宜的誘變時間，所以本實驗認為，對于黑曲霉孢子誘變來說，在85℃時高溫水浴時間應(yīng)為10min左右。

2.2 亞硝基胍誘變時間的確定

由圖2可以看出，黑曲霉孢子的存活率隨誘變時間的延長而降低，對圖2中的數(shù)據(jù)進行擬合得到方程:

圖2 NTG誘變時間對致死率的影響

方程式(3)說明黑曲霉孢子受NTG致死規(guī)律遵守分子反應(yīng)速率，基本符合化學反應(yīng)的一級反應(yīng)動力學。由圖2還可以看出，當誘變時間為4min時，存活率為25%，致死率約為76%左右，可以認為是適宜的誘變時間，因此，當用濃度為1mg/mL的NTG作誘變劑時，適宜的誘變時間應(yīng)為4min左右。

2.3 突變株篩選

誘變后菌株的產(chǎn)酸結(jié)果見表1。

表1 突變菌株發(fā)酵產(chǎn)酸結(jié)果

由表1可以看出，經(jīng)過復(fù)合誘變后挑選的10株黑曲霉突變株中，產(chǎn)酸率都得到了不同程度的提高，其中產(chǎn)酸率最高的為13.76%，增幅可達44.84%，這說明經(jīng)過85℃高溫和NTG復(fù)合誘變，可以明顯提高黑曲霉菌株的生產(chǎn)能力。由表1還可以看出，產(chǎn)酸增幅比較大的黑曲霉菌株往往變色圈直徑(T)與菌落直徑(J)的比值較大，但是并不呈正比關(guān)系，這可能與菌種形態(tài)和產(chǎn)孢子能力有一定關(guān)系，結(jié)合表1產(chǎn)酸結(jié)果和實驗過程中對菌株形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，菌落直徑較大，中間凹陷，邊緣不規(guī)則，顏色較淺，孢子較少的菌株，即使變色圈很大，但是搖瓶發(fā)酵效果依然不好。

2.4 突變株穩(wěn)定性考察

從搖瓶產(chǎn)酸結(jié)果中篩選出產(chǎn)酸率較高的TN－02、TN－05和TN－10三個菌株，進一步傳代培養(yǎng)，以考察菌株的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。

表2 突變株穩(wěn)定性考察

由表2可以看出，三株高產(chǎn)菌株中，TN－02遺傳比較穩(wěn)定，平均產(chǎn)酸率為13.61%，產(chǎn)酸增幅達到43.2%，TN－10遺傳基本穩(wěn)定，平均產(chǎn)酸率可以達到13.12%，TN－05在傳代5次之后，生產(chǎn)能力有所下降，從第一代的12.95%下降到第五代的12.08%，因此本實驗認為TN－02產(chǎn)酸率較高，穩(wěn)定性能也較好，是一株較優(yōu)良的突變株。

3 結(jié)論

通過存活率與誘變時間的測定，確定了黑曲霉單孢子懸液在85℃高溫時適宜的誘變時間為10min，濃度為1mg/mL的亞硝基胍的誘變時間為4min。

采用85℃高溫和亞硝基胍復(fù)合誘變對產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉菌種進行了誘變，并通過溴甲酚綠平板初篩和搖瓶復(fù)篩，篩選出了三株產(chǎn)酸增幅較高的菌株，通過對三株菌株的穩(wěn)定性考察，獲得了一株遺傳性能穩(wěn)定、平均產(chǎn)酸率為13.61%高產(chǎn)菌株TN－02，產(chǎn)酸增幅達到43.2%，說明高溫和亞硝基胍復(fù)合誘變對黑曲霉菌種選育來說是一種較好的誘變方法。

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Study on the breeding of citric acid production strains

REN Xiao－li1，2，ZHAO Lin1，*，ZHAO Run－zhu2
(1.School of Environmental Science and Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China;2.Department of Environmental Engineering，Taiyuan Institute of Technology，Taiyuan 030008，China)

TS201.3

A

1002－0306(2010)08－0151－03

2010－02－23 *通訊聯(lián)系人

任曉莉(1974－)，女，副教授，在職博士后，研究方向:生物化工。