動物蛋白酶酶解制備廣西產牡蠣肉抗腫瘤活性肽的實驗研究

陳艷輝，李超柱，黎丹戎，蔣 維，孫聞續，李家明，方懷儀

(1.廣西欽州學院，廣西欽州535000;2.廣西醫科大學，廣西南寧530021)

動物蛋白酶酶解制備廣西產牡蠣肉抗腫瘤活性肽的實驗研究

陳艷輝1，李超柱1，黎丹戎2，*，蔣 維2，孫聞續2，李家明1，方懷儀1

(1.廣西欽州學院，廣西欽州535000;2.廣西醫科大學，廣西南寧530021)

目的:采用動物蛋白酶作為工具酶對牡蠣蛋白質進行酶解，并對酶解條件采用正交實驗進行優化。以期獲得具有抑制腫瘤細胞生長的活性肽。方法:利用正交實驗L9(33)，以氨基氮生成率和腫瘤細胞生長抑制率為觀察指標，確定動物蛋白水解酶水解廣西產牡蠣肉的水解條件如溫度、酶量、水解時間，并對最佳水解產物進行柱層析和超濾分離獲得不同分子量的多肽，采用MTT法檢測了各組分對鼻咽癌細胞CNE－1生長的抑制作用。結果:動物蛋白水解酶在60℃、酶的質量分數2.0‰、水解時間為4h的水解條件下獲得的水解氨基氮含量最高;水解產物在分子量為小于3000Da多肽具有明顯地抑制鼻咽癌CNE－1細胞的生長作用。結論:選取動物蛋白水解酶作用的最佳條件，可以獲得具有抗腫瘤細胞生長的牡蠣蛋白活性肽，具有進一步開發應用的價值。

牡蠣，活性肽，抗腫瘤

Abstract:Objective:Using animal protein proteasome as a tool enzyme to enzymatic hydrolyze with oyster protein，the bioactive peptide that can inhibit the growth of tumour cells was obtained，and condition of enzymatic hydrolysis was optimized by orthogonal experiment.Methods:according to observed indicators of amino nitrogen production rate and tumor cell growth inhibition，definite technological parameters of the hydrolysis conditions such as temperature，enzyme amount and time on hydrolyzing Guangxi oyster by animal protein zymohydrolysis were determined by orthogonaltestL9(33).Polypeptideofdifferentmolecularweightbymeansofcolumn chromatography，ultrafiltration of the best hydrolysate was gotten.The inhibited effects of all the constituents on the growth of nasopharyngeal carcinoma cells CNE－1 were tested by MTT.Results:The highest content of hydrolysis amino nitrogen was obtained on the condition that the temperature of animal protein zymohydrolysis of 60℃，that mass fraction of the enzyme of 2.0‰，and that hydrolyzing time of 4h.The polypeptide that with less than 3000Da molecular weight has evident inhibited effects on the growth of nasopharyngeal carcinoma cells CNE－1.Conclusion:We can get oyster protein bioactive peptide that can inhibit the growth of tumour cells on the best condition of animal protein zymohydrolysis.The research is worth a further development and application.

Key words:oyster;bioactive peptide;antitumor

蛋白質是一類最重要的生物大分子，是生物功能的主要載體。天然蛋白質不完全水解產生的長短不一的一些肽段具有其前體所沒有的特殊生理功能，這些有特殊的生理活性的肽類稱為生物活性肽，而非活性肽在體內僅起氨基酸營養源的作用。海洋天然活性物質抗腫瘤研究是抗腫瘤藥物研發的一個重要領域［1］，但有關海洋生物活性肽抗腫瘤作用研究則仍未得到足夠重視。這是因為天然存在的海洋活性肽在生物體中含量低，而且提取困難，難以實現大量生產，化學合成的活性肽成本昂貴［2］。因此有必要以來源豐富的海洋動物蛋白為原料，水解分離具有特殊活性的小分子肽段，實現規?；笊a小分子多肽。牡蠣也稱大蠔，是廣西欽州海洋水產品中產量最高的經濟貝類。大量的文獻報道稱，牡蠣提取物或蛋白水解物中存在著免疫調節、抗腫瘤的生物學效應、抗氧化、抗衰老、降血糖作用及抗病毒抗菌等功能物質［3－4］。為了進一步開發牡蠣的藥用資源，尋找結構特異、活性獨特的抗腫瘤活性多肽，本課題利用動物蛋白酶為工具酶，探討酶水解牡蠣蛋白的最佳條件，并測定了各水解產物的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

牡蠣 購自廣西欽州水產品市場，經廣西水產研究所李詠梅研究員鑒定為近江牡蠣(Crassostrea rivularis);乙腈、甲醇 色譜純，Merck公司;動物蛋白水解酶 ≥200U·mg－1，廣西南寧龐博生物工程有限公司。

多功能食品粉碎機 上海海菱公司;高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;紫外檢測儀 日本島津儀器有限公司;數字酸度計 上海大普儀器有限公司;微型等電聚焦電泳儀 美國BIO－RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣肉的酶解工藝的確定 取牡蠣肉，清洗，勻漿，選擇動物蛋白酶，酶解工藝條件的設計見表1，分別在各反應條件下進行牡蠣肉蛋白質的水解實驗。酶解結束后，95℃滅酶，分別測定每一反應條件下氨基氮生成率。

表1 動物蛋白酶水解牡蠣肉蛋白質的正交實驗因素水平表

1.2.2 氨基氮生成率的測定 采用甲醛滴定法測定氨基氮總量，凱氏定氮法測定總氮。氨基氮生成率按照下式計算:

氨基氮生成率(%)=(游離氨基氮總量/總氮)×100%

1.2.3 牡蠣酶解液中活性肽的分離制備工藝路線原料蛋白→預處理→選擇最佳酶解條件水解→高溫滅酶→活性炭脫苦味去色→柱層析、超濾膜分離→冷凍干燥→組成與結構鑒定

1.2.4 牡蠣肽對鼻咽癌CNE－1細胞生長抑制作用取指數生長期CNE－1細胞用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培養液計數并稀釋至1×105個/mL。將稀釋的細胞懸液按100μL/孔接種至96孔板，置于37℃，5%的CO2培養箱中孵育24h至細胞貼壁后，加入不同分子量大小及不同濃度的牡蠣活性肽，每個濃度設3個平行孔，繼續培養24h，加入20μL的5mg/mL的MTT，于37℃、5%的CO2條件下孵育4h，棄盡孔內液，每孔中加入100μL的DMSO溶解MTT產物。用酶標儀振蕩30s后于490nm處測定每個孔的OD值。實驗中另設只加細胞而不加任何藥物的空白對照組，以PBS補足體積。按下列公式計算抑制率:

生長抑制率(%)=(1－用藥平均A值/對照平均A值)×100%

當生長抑制率為50%時所對應的活性肽濃度稱為半數抑制濃度IC50。

2 結果與分析

2.1 酶水解條件的選擇與確定

采用正交設計研究了溫度、加酶量和反應時間3個單因素對酶解液水解率的影響，優化動物蛋白酶的酶解工藝參數，確定最佳酶解條件。由表2可見:影響動物蛋白酶酶解液氨基氮生成率和抗腫瘤活性的主要因素依次為溫度＞時間＞酶用量，其中酶解溫度對動物酶解液的抗腫瘤活性影響最大，在酶解時間相同的條件下，隨著酶解溫度的增加，牡蠣蛋白的水解度增大，溫度為60℃時，動物蛋白酶對牡蠣蛋白的水解度最大。溫度對反應速率的影響主要是影響反應速率常數，在較低的溫度范圍內，反應速率常數隨著溫度的增加而增加，因而酶反應速率增加。加入酶的量越多，水解程度越高，在溫度60℃時，2‰的酶量，4h后蛋白已水解徹底。且水解程度越高，對鼻咽癌細胞的生長抑制作用越強，IC50值越小，結果見表2。

表2 蛋白酶水解正交實驗方案及實驗結果

2.2 牡蠣肽不同水解分子對鼻咽癌細胞生長的影響

本研究所采用的動物酶主要含有胰蛋白酶和Flavourzyme，該復合酶共同作用的水解產物的多肽分子量分布是連續的，其范圍主要分布在2000～50000Da之間，而60%的水解產物主要集中在小于1000～3000Da間。從表2的實驗結果可見，牡蠣蛋白經酶解反應后其產物抗癌活性有較大的差異，說明酶解反應過程的生成眾多的短肽和游離的氨基酸，其中可能含有長度不同的多肽具有抑制腫瘤細胞生長的作用。因此，本研究將對鼻咽癌細胞抑制作用最強的水解產物進一步分離、超濾后獲得不同分子量大小的多肽，不同濃度的牡蠣多肽作用于鼻咽癌CNE－1細胞后，采用MTT法測定其對細胞的生長抑制作用。從表3可以看出，分子量為3000Da的牡蠣多肽對鼻咽癌CNE－1細胞的生長抑制率出現明顯的量效關系，即濃度越高，抑制率越強。能夠抑制腫瘤細胞生長的活性肽主要存在于分子量小于14000Da的肽段中。

表3 不同濃度的牡蠣多肽對鼻咽癌CNE－1細胞的生長抑制率(n=3)(%)

3 討論

由于利用蛋白酶解制備小分子多肽可實現規模化大生產，目前，活性肽的主要生產方法通過酶法制備，而酶的選擇是生產活性肽的關鍵，酶的水解能力具有專一性，若想獲得具有獨特活性的多肽，單用一種酶有時效果不佳［6］，因此本研究采用動物蛋白水解復合酶系，該酶是由蛋白內切酶、外切酶和風味酶組成。評價水解產物優劣，過去一般以水解度(DH)和肽的得率為指標，本研究還結合活性肽對腫瘤細胞的生長抑制作用強弱為指標，綜合評判牡蠣活性肽的水解效果。結果發現，水解氨基氮含量高的組分，活性肽分子量小于3000Da的水解產物，其抑制鼻咽癌細胞生長的能力較強。

在研究動物蛋白水解酶水解牡蠣蛋白的最佳水解條件時，本研究發現最適溫度不是酶的特征常數，只有在固定時間條件下才有意義。隨著時間的延長，酶的活力逐漸衰減，比如酶解3h的最適溫度必然不同于酶解4h的最適溫度，這一點常為國內文獻所忽視。酶量過高時，由于酶本身的相互水解作用加強，會阻礙酶對底物的水解，并非酶量越多越好。在最佳反應條件下，隨時間的推移，水解程度加大，水解產物的分子量減小，水解液的肽段分子量分布會不斷地發生變化。因此進行大規模水解牡蠣蛋白前必須進行水解條件的優化組合。

超濾原理近似機械篩分，是利用膜的選擇性，以膜兩側存在的一定量能量差作為推動力，通過溶液中各組分透過膜的遷移速率的不同而實現非均相物系的分離。由于超濾膜具有不對稱微孔結構，且采用薄層流道和湍流促進結構，減少膜的污染，在分離過程中，使得大分子溶質和微粒(如膠體或淀粉等)隨溶液切向流經膜表面，而小分子物質和溶劑則在壓力驅動下穿過致密層上的微孔而進入膜的另一側，因而超濾膜可以長期連續使用并保持較恒定的產量和分離效果。與傳統工藝相比較，超濾不僅可以提高產品的純度、節約溶劑或試劑的耗用量，而且能夠實現連續化分離純化，縮短生產周期。正是利用這一節能減排的技術，本研究獲得了具有較強抗腫瘤活性，分子量小于3000Da的多肽。因此有必要進一步對分子量低于14000Da的多肽進行系統的分離純化，以其獲得更多的活性分子。

［1］林文翰.我國海洋生物的藥學研究思考［J］.中國天然藥物，2006，4(1):10－14.

［2］韓玉謙，馮曉梅，管華詩.海洋活性多肽的研究進展［J］.中國海洋大學學報，2004，34(5):761.

［3］林偉鋒，趙謀明，程朝陽.海洋生物活性肽的制備及其研究狀況［J］.食品工業科技，2003(9):90－93.

［4］李鵬，李祺福，黃大川，等.僧帽牡蠣天然活性多肽BPO21抗人胃腺癌BGC2823細胞活性研究［J］.廈門大學學報:自然科學版，2002，41(5):618.

［5］Je J，Park P，M S.Antioxidant activity of a peptide isolated from Alaska Pollack(Theragra chalkogra)from protein hydrolysate［J］.Food Research International，2005，38:45－50.

［6］蔣傳葵.工具酶的活力測定［M］.上海:上海科學技術出版社，1982:104－168.

Experimental research on animal proteasome enzymatic hydrolysis for preparing antitumor bioactive peptide from oyster of Guangxi province

CHEN Yan－hui1，LI Chao－zhu1，LI Dan－rong2，*，JIANG Wei2，SUN Wen－xu2，LI Jia－ming1，FANG Huai－yi1
(1.Qinzhou College of Guangxi，Qinzhou 535000，China;2.Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

TS201.2

A

1002－0306(2010)08－0167－03

2009－12－30 *通訊聯系人

陳艷輝(1958－)，女，副教授，研究方向:天然產物化學和有機合成化學。

廣西自然基金(桂科自0832281);廣西教育廳面上項目(200708MS072、200911MS241)。