應用Plackett-Burman設計法對屎腸球菌BC-3產類細菌素發酵主要影響因素的篩選

閔鐘熳，岳喜慶，蔡瑋璠，郭 晨

(沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110161)

應用Plackett-Burman設計法對屎腸球菌BC-3產類細菌素發酵主要影響因素的篩選

閔鐘熳，岳喜慶*，蔡瑋璠，郭 晨

(沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110161)

通過單因素實驗選出屎腸球菌(Enterococcus faecium)BC－3產類細菌素發酵培養基最佳碳源為蔗糖，氮源為牛肉膏+蛋白胨+酵母膏，刺激因子為吐溫80;采用Plackett－Burman設計法對選取的10個相關影響因素進行了評價，篩選出了3個主要影響因素分別為牛肉膏、蛋白胨、檸檬酸二銨，且3個因素在PB設計的水平范圍內，對響應值的影響均為正效應。

屎腸球菌，類細菌素，Plackett－Burman設計，影響因素，發酵

Abstract:In the fermentation of Enterococcus faecium BC－3 produced bacteriocin－like substance experiment，single factor design was used to determine that sucrose was the best carbon source，beef extract，peptone and yeast extract were suitable nitrogen sources，and stimulating factor was tween 80.Subsequently，the methodology of Plackett－Burman design was undertaken to evaluate the influence of the ten related factors.Three statistically significant parameters including beef extract，peptone and dibasic ammonium citrate were selected，and all of them influenced bacteriocin－like substance production positively within designed level.

Keywords:Enterococcus faecium;bacteriocin－like substance;Plackett－Burman design;affecting factor;fermentation

類細菌素是指某些細菌在代謝過程中合成并分泌到環境中的具有抑菌作用的多肽或蛋白質［1－2］。乳酸菌群中的屎腸球菌(Enterococcus faecium)可以產生類細菌素，且這些類細菌素分子量小、熱穩定性強［1］、抑菌譜寬，尤其對食源性病原單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)有強烈的抑制作用，成為食品、飼料及醫藥領域中現有防腐劑和抗生素的替代物［1］。屎腸球菌發酵產生類細菌素的產量與培養基的組分如碳源、氮源、生長因子及無機鹽等多種因素有關，如何快速有效地篩選出影響類細菌素產量的主要因素并進行優化是該研究領域的關鍵問題。Plackett－Burman(PB)設計法是一種經濟有效的二水平實驗設計方法［3－4］，可以利用最少的實驗次數，從眾多考察因素中快速有效地篩選出主要的影響因素，故而廣泛應用于因素主效應的估計研究［5－8］。本研究以一株屎腸球菌(Enterococcus faecium)BC－3為出發菌株，采用PB設計法并通過MINITAB15統計分析軟件對影響Enterococcus faecium BC－3菌株發酵產生類細菌素的主要影響因素進行了篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

屎腸球菌(Enterococcus faecium)BC－3 分離自北方傳統發酵酸菜;單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111 本實驗室保藏;實驗菌Enterococcus faecium BC－3培養 MRS培養基，2%接種量，37℃培養至對數生長后期;指示菌 Listeria monocytogenes ATCC19111培養 TSB－YE培養基，2%接種量，30℃培養18h。

1.2 實驗方法

1.2.1 抑菌效果測定 采用雙層瓊脂平板擴散法［9］，測量抑菌圈直徑，取三次實驗平均值。

1.2.2 菌體生長測定 采用WFZ－UV－2100型紫外－可見分光光度計測菌體吸光度(A600)。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 碳源的影響 保持MRS培養基中其他組分不變，只改變碳源，30℃培養20h，測定發酵液的抑菌圈直徑和菌體吸光度。

1.2.3.2 氮源的影響 保持MRS培養基中其他組分不變，只改變氮源。6種處理如下:蛋白胨25g/L，牛肉膏25g/L，酵母膏25g/L，蛋白胨+牛肉膏12.5+12.5g/L，牛肉膏+酵母膏12.5+10g/L，蛋白胨 +牛肉膏 + 酵母膏 10+10+5g/L［10］。30℃ 培養 20h，測定發酵液的抑菌圈直徑和菌體吸光度。

1.2.3.3 刺激因子－吐溫的影響 保持MRS培養基中其他組分不變，只改變吐溫種類和濃度，30℃培養20h，測定發酵液的抑菌圈直徑和菌體吸光度。

1.2.4 Plackett－Burman(PB)設計 根據單因素實驗確定的培養基組分及前期工作確定的各組分濃度范圍，對影響發酵培養基的10個因素進行考察。按PB設計安排主要影響因素的篩選實驗，每個因素選取低濃度和高濃度分別作為PB實驗中的低水平“－1”、“+1”，響應值為抑菌圈直徑(mm)，自變量及其代號、編碼和水平見表1［11］。

表1 Plackett－Burman設計的因素水平及編碼

1.2.5 數據分析 MINITAB 15數據分析軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 碳源的確定 不同碳源對Enterococcus faecium BC－3生長和產類細菌素的影響見圖1。結果顯示，蔗糖作為最易被利用的碳源，菌體生長量(吸光度A6003.18±0.10)及類細菌素產量(抑菌圈直徑為13.49±0.10mm)均最高，其次為麥芽糖(吸光度A6002.93±0.03;抑菌圈直徑為13.06±0.12mm)。由此可以看出該菌株最容易利用雙糖，其次為單糖，對可溶性淀粉利用稍差。這與張國強等［12］報道的相似，這可能與類細菌素的碳源代謝機制有關。

2.1.2 氮源的確定 不同氮源對Enterococcus faecium BC－3生長和產類細菌素的影響見圖2。結果顯示，Enterococcus faecium BC－3在單一氮源牛肉膏中菌體生長最快(吸光度A600為3.01±0.02)，在含有牛肉膏+蛋白胨+酵母膏的復合氮源培養基中產類細菌素能力最高(抑菌圈直徑為13.30±0.10mm)，其次為蛋白胨+牛肉膏(抑菌圈直徑為12.80±0.18mm)。而使用酵母膏作為單一氮源時，會導致菌體生長不良，類細菌素合成受限制。當酵母膏與蛋白胨、牛肉膏復合添加到培養基時，其產類細菌素能力提高，這與Todorov S D等［10］的發現相似。與蛋白胨+牛肉膏培養基相比，復合培養基中添加了酵母膏，同時降低了蛋白胨的添加量(過多的蛋白胨對類細菌素的提取純化造成干擾)［13］，類細菌素的產量仍有提高，因此實驗確定采用復合氮源牛肉膏+蛋白胨+酵母膏。

圖1 碳源對Enterococcus faecium BC－3生長及產類細菌素的影響

圖2 氮源對Enterococcus faecium BC－3生長及產類細菌素的影響

2.1.3 刺激因子—吐溫的影響 吐溫對Enterococcus faecium BC－3生長和產類細菌素的影響見圖3。結果顯示，吐溫20、吐溫80對類細菌素的產生都有促進作用，這與呂燕妮等［14］報道的相同，吐溫對類細菌素的產量有重要影響。但研究中發現低濃度的吐溫更利于類細菌素的產生，而高濃度的吐溫對類細菌素的產生有抑制作用;其中0.1%吐溫80最適合類細菌素產生(與0.3%吐溫80相比抑菌圈直徑提高4.77%)。

圖3 吐溫對Enterococcus faecium BC－3生長及產類細菌素的影響

2.2 培養基組分主要影響因素的確定

Plackett－Burman設計實驗結果見表 2，借助MINITAB15設計軟件進行方差分析，結果見表3，并得到響應值(類細菌素抑菌圈直徑)與各因素間的回歸模型:

Y=14.94+0.12x1+0.21x2+0.54x3+0.14x4+0.05x5－0.03x6+0.19x7－0.04x8－0.16x9－0.14x10

式中:Y為類細菌素抑菌圈直徑的預測值，x1、x2、… x10為自變量編碼值。

表2 Plackett－Burman實驗設計及結果

表3 Plackett－Burman設計實驗結果方差分析

對回歸模型進行方差分析，可知，該模型顯著(P=0.097);模型的調整確定系數為R2Adj=0.9828，說明該模型能解釋98.28%響應值的變化，實驗誤差小，因而該模型是合適的。從表3可知，x2、x3、x7的P＜0.1，為顯著影響因素(在90%概率水平上差異顯著)，即蛋白胨、牛肉膏、檸檬酸二銨為產類細菌素發酵培養基的主要影響因素，且由T值可知，三因素對類細菌素產生的影響均為正效應。因此增加x2、x3、x7因素上的水平，會使類細菌素的產量增加。

分析因素影響圖可知，柱狀圖超出虛線的因素是輸出均值的重要影響因素。從圖4可以看出x2、x3、x7三因素為顯著影響因素，與表2數據分析的顯著因素一致。

圖4 標準化效應的柏拉圖

3 結論

采用單因素實驗確定起始培養基后，再用PB設計法，可以以較少的實驗次數快速地從眾多相關影響因素中篩選出主要影響因素，為進一步的優化實驗指明方向［15］。本實驗以傳統發酵酸菜中分離出的Enterococcus faecium BC－3為出發菌株，經前期研究發現該菌株產生的類細菌素熱穩定性高(121℃熱處理15min時，抑菌活性仍保持90%以上)，pH作用范圍廣(pH2.0～12.0)，能抑制革蘭氏陽性、陰性細菌以及真菌，具有廣泛的潛在應用價值。因此通過對產類細菌素的發酵培養基進行優化研究，對于提高產量有重要的現實意義，這也是國內首次對該菌株發酵培養基進行優化研究。通過研究發現，影響該菌株產類細菌素發酵培養基的主要因素為:蛋白胨、牛肉膏、檸檬酸二銨;且在PB設計的水平范圍內，三者均為正效應。由此也可推斷發酵培養基中的氮源對提高類細菌素的產量至關重要。

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Application of Plackett－Burman design in screening the main affecting factors in the fermentation of the bacteriocin－like substance from Enterococcus faecium BC－3

MIN Zhong－man，YUE Xi－qing*，CAI Wei－fan，GUO Chen
(Food College，Shenyang Agriculture University，Shenyang 110161，China)

TS201.3

A

1002－0306(2010)08－0176－04

2009－11－18 *通訊聯系人

閔鐘熳(1982－)，女，博士研究生，研究方向:動物性食品加工新技術。

遼寧省創新團隊項目(2009T085)。