酸菜中莢膜酵母產(chǎn)輔酶Q_(10)前體物質(zhì)添加優(yōu)化培養(yǎng)條件的研究

魏寶東，馬明慧，崔玉燦

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110161)

酸菜中莢膜酵母產(chǎn)輔酶Q_(10)前體物質(zhì)添加優(yōu)化培養(yǎng)條件的研究

魏寶東，馬明慧，崔玉燦

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110161)

選用酸菜中的莢膜酵母為出發(fā)菌株，通過培養(yǎng)基的優(yōu)化來提高輔酶Q10產(chǎn)量。研究不同的碳源、氮源、前體物質(zhì)添加對輔酶Q10產(chǎn)量的影響。確定了菌種最佳培養(yǎng)時間為48h，最佳培養(yǎng)基組成為蔗糖4%、酵母浸粉4%、NaCl 0.5%，pH7.0，輔酶Q10產(chǎn)量最大，為46.32mg/L。當添加對羥基苯甲酸濃度為1.2mg/L時，輔酶Q10含量達到最大，為49.58mg/L，比不添加時含量增加了7%。

輔酶Q10，優(yōu)化，前體物質(zhì)

Abstract:Selecting sauerkraut as starting yeast strains，the production of coenzyme Q10was improved through the optimization of the culture medium.The influences of different carbon resources，nitrogen resources and precursor substances on the yield of coenzyme Q10were studied.The optimum medium composition was as follows:4%sucrose，4%yeast powder Baptist，0.5%NaCl，pH7.0.The best cultivating time was 48h.The maxium production of Coenzyme Q10was 46.32mg/L.Adding 1.2mg/L of p－h(huán)ydroxybenzoate to the culture medium，the maxium production of Coenzyme Q10reached 49.58mg/L，which was 7%more than without adding.

Key words:coenzyme Q10;optimization;precursor substances

輔酶Q10，俗稱泛醌，維生素的一種，廣泛存在于大自然的很多生物體中。輔酶Q10是人體不可缺少的一種輔酶，能作為代謝活性劑激活細胞呼吸、加速呼吸鏈的產(chǎn)能過程;對心臟、肝臟和腎有良好的保健作用，可預(yù)防動脈硬化、中風和高血壓;其次還有抗腫瘤和提高免疫力作用，另外還有延緩皮膚衰老的作用［1］。輔酶Q10作為生物體內(nèi)細胞產(chǎn)生能量的重要酶以及重要代謝反應(yīng)的底物，具抗腫瘤、抗氧化性，以及作為細胞代謝激活劑，可提高人體免疫力和治療人體免疫系統(tǒng)疾病，特別在心血管疾病治療中有重要作用。因此，輔酶Q10可作為一種新型的具有重大醫(yī)學價值的生化藥物或可開發(fā)作為保健食品的良好材料［2］。隨著對輔酶Q10應(yīng)用研究的不斷深入，其應(yīng)用范圍及其產(chǎn)品開發(fā)會進一步發(fā)展，輔酶Q10產(chǎn)品的研究生產(chǎn)一定會有美好的前景。相比于動植物組織提取法、化學合成法、植物細胞培養(yǎng)法等生產(chǎn)方式，微生物發(fā)酵法比較經(jīng)濟，易于大規(guī)模生產(chǎn)、分離純化，且產(chǎn)品活性好、易被人體吸收，是一種最有前途的方法。迄今為止，國內(nèi)外報道的輔酶Q10產(chǎn)生菌主要有酵母菌和細菌［3］。本文選用酸菜中的莢膜酵母為出發(fā)菌株生產(chǎn)輔酶Q10，通過對培養(yǎng)條件的優(yōu)化來提高輔酶Q10的產(chǎn)量，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸菜莢膜酵母菌 本實驗室保存;種子培養(yǎng)基(g/L) 蔗糖20、酵母浸粉 20、NaCl 5、蒸餾水 1，pH7.0;斜面培養(yǎng)基(g/L) 瓊脂20、蔗糖20、酵母浸粉20、NaCl 5、蒸餾水 1，pH7.0;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)蔗糖40、酵母浸粉 20、蛋白胨20、NaCl 5，pH7.0。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、紫外分光光度計 沈陽農(nóng)業(yè)大學設(shè)備科。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 在250mL錐形瓶中倒入50mL種子培養(yǎng)基，于0.7×105Pa，115℃條件下滅菌30min。然后從斜面培養(yǎng)基接種倒入錐形瓶中，于27℃，170r/min條件下培養(yǎng)48h，作為種子液。同樣裝有50mL發(fā)酵液的錐形瓶，高壓滅菌后接種，接種量為10%。放入恒溫搖床中，27℃，170r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 輔酶Q10標準曲線的繪制 準確稱取2.0mg輔酶Q10標準樣品，用無水乙醇定容至100mL，配成質(zhì)量濃度為0.02mg/mL 標準溶液。分別移取 1、2、3、4、5、6、7、8、9mL該標準溶液到10mL 容量瓶中，用無水乙醇定容至10mL，在輔酶Q10最大吸收波長275nm下測定其吸光度。

1.2.3 菌種干重的測定 將稱量瓶預(yù)先在烘箱105℃烘1d至干重，取10mL發(fā)酵液4000r/min離心30min，收集沉淀，用無菌水洗滌一次，將洗滌后的沉淀用無菌水洗入稱量瓶，將稱量瓶和菌體在50℃烘箱中干燥至恒重后放入干燥器中，冷卻30min，稱量，并計算菌體干重［4］。

1.2.4 菌體最佳培養(yǎng)時間的確定 在種子培養(yǎng)過程中，每隔4h測定菌體干重并計算發(fā)酵液中菌體的濃度，繪制生長曲線。

1.2.5 碳源對發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響 基本培養(yǎng)基2%酵母浸粉，0.5%NaCl，pH=7.0;碳源分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉，濃度均為4%。在基本培養(yǎng)基中添加不同的碳源配成發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后搖床培養(yǎng)96h，測定菌體干重和輔酶Q10含量并確定最佳碳源。

1.2.6 氮源對發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響 基本培養(yǎng)基2%蔗糖，0.5%NaCl，pH=7.0;氮源分別為蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、玉米漿，濃度均為4%。在基本培養(yǎng)基中添加不同的氮源配成發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后搖床培養(yǎng)96h測定菌體干重和輔酶源Q10含量，并確定最佳氮源。

首先確定最佳碳源和最佳氮源，最佳濃度即可確定;再進行碳、氮源正交實驗，以確定最佳配比［5］。

1.2.7 對羥基苯甲酸對輔酶Q10含量的影響 在優(yōu)化培養(yǎng)基中添加對羥基苯甲酸濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/L，發(fā)酵48h后測菌體干重和輔酶 Q10的含量。

1.2.8 輔酶Q10提取方法 搖床結(jié)束后取50mL發(fā)酵液，4000r/min離心30min，收集菌體，用蒸餾水充分洗滌。將菌體移入150mL圓底燒瓶內(nèi)，加入0.7g焦性沒食子酸，2.5g氫氧化鉀，19mL甲醇，7mL蒸餾水，混勻。在90℃水浴鍋中回流30min，用自來水迅速冷卻至室溫，倒入分液漏斗，加入石油醚40mL，劇烈振蕩5min，萃取輔酶Q10，連續(xù)萃取3次，合并萃取液，用自來水洗滌至中性，加入5g無水硫酸鈉，干燥至液體澄清。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(50℃)濃縮至干，揮發(fā)完全，加入5mL無水乙醇，放入冰箱冷凍析出膽固醇等雜質(zhì)，過濾定容至 100mL，待測［6］。

1.2.9 發(fā)酵菌體中輔酶Q10含量的測定 在275nm下測定輔酶Q10吸光度(A)，根據(jù)標準曲線計算其中輔酶Q10的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 輔酶Q10標準曲線的繪制

輔酶Q10的標樣為實驗室保存。如圖1所示，在相同的吸光度條件下，測定不同濃度的標準溶液中輔酶Q10的吸光度。因標準溶液中輔酶Q10的含量不同，所以測出的吸光度大小是不同的，根據(jù)吸光度的大小繪制出標準曲線，再根據(jù)標準曲線去測定本實驗選用的酸菜莢膜酵母產(chǎn)輔酶Q10的含量。

圖1 標準曲線

2.2 菌體最佳培養(yǎng)時間的確定

菌體干重在12h以前產(chǎn)量不高，12h后細胞生長速率明顯加快，由圖2可以看出，48h時菌體干重達到最大值100.78g/L。通常選擇到達穩(wěn)定期前2h的階段作為最佳菌體培養(yǎng)時間，因為這一階段是菌體生長對數(shù)期，菌體的生長速率常數(shù)最大，細胞平衡生長，酶系活躍，代謝旺盛，可作為發(fā)酵生產(chǎn)的良好種子。故確定48h為最佳培養(yǎng)時間。

圖2 菌體生長曲線

2.3 不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響

由圖3可看出，蔗糖作為碳源效果是最好的，產(chǎn)量最高，其次是葡萄糖，輔酶 Q10含量分別為41.02mg/L和33.11mg/L，菌體干重分別為98.9g/L和64.7g/L;以麥芽糖和可溶性淀粉作為碳源所產(chǎn)輔酶Q10含量較少，干重也較小。故確定以蔗糖作為發(fā)酵碳源。

圖3 不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響

2.4 蔗糖濃度對發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響

以不同的蔗糖濃度配制發(fā)酵液，從而確定蔗糖的最佳濃度。由圖4可看出，隨著發(fā)酵液中蔗糖濃度的升高，輔酶Q10產(chǎn)量隨之升高，在40g/L時輔酶Q10產(chǎn)量達到最大值 41.023mg/L，菌體干重達到98.94g/L;之后蔗糖濃度再升高，輔酶Q10含量反而下降，干重也跟著減小。故確定蔗糖的最佳濃度為40g/L。

圖4 蔗糖濃度對發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響

2.5 不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響

本實驗用了4種氮源進行比較，分別為蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、玉米漿。由圖5可看出，當選擇酵母浸粉作為培養(yǎng)基氮源時，輔酶Q10含量最高，為44.71mg/L，菌體干重為99.52g/L;其次是蛋白胨，牛肉膏和玉米漿較差。故選擇酵母浸粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

圖5 不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響

2.6 酵母浸粉濃度對發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響

在培養(yǎng)基中添加不同濃度的酵母浸粉，測定不同濃度條件下輔酶Q10含量和菌體干重，從而確定酵母浸粉的最佳濃度。由圖6可以看出，隨著酵母浸粉濃度的升高，輔酶Q10含量升高。當酵母浸粉濃度為40g/L時，輔酶 Q10含量最高，為44.71mg/L，菌體干重為99.52g/L;之后，隨著濃度的升高，輔酶Q10的含量和干重都減小。故酵母浸粉的最佳濃度確定為40g/L。

圖6 酵母浸粉濃度對發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響

2.7 碳氮源最佳配比的選擇

通過單因素實驗確定出最佳碳、氮源濃度，且碳、氮源同時加入培養(yǎng)基中還會產(chǎn)生相互作用，從更全面的角度考慮，混合的碳、氮源也許更適合菌種的生長。因此，本實驗選用了兩種不同的碳源，蔗糖和葡萄糖;兩種不同的氮源，酵母浸粉和蛋白胨，進行了正交實驗，見表1～表3，以確定碳源和氮源的最佳配比，其結(jié)果如表2所示。

表1 因素水平表

表2 碳氮源濃度對發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響

表3 方差分析表

由表2可知，影響輔酶Q10含量的因素依次為蔗糖＞酵母浸粉＞葡萄糖＞蛋白胨，并且蔗糖、酵母浸粉的極差顯著。由表2數(shù)據(jù)可知，最優(yōu)方案為A3B3C3D3，當培養(yǎng)基組成為蔗糖4%、酵母浸粉4%時輔酶Q10含量最大，為46.32mg/L。可初步確定在此碳氮濃度配比下發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10效果最好。

2.8 對羥基苯甲酸對輔酶Q10含量的影響

由輔酶Q10的生物合成途徑可知:對羥基苯甲酸是輔酶Q10合成途徑中醌環(huán)核心的前體物，它與聚異戊烯基焦磷酸結(jié)合，最終生成輔酶Q10。而對羥基苯甲酸作為常用防腐劑對菌體本身有毒害作用，因此針對此矛盾可以設(shè)想一定存在一個對羥基苯甲酸的最佳作用濃度，使得在保證菌體生物量有較高值時輔酶Q10的含量達到最大，本節(jié)即對對羥基苯甲酸對酵母菌生物量和輔酶Q10合成的影響做了研究。

在優(yōu)化培養(yǎng)基中添加對羥基苯甲酸濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/L，發(fā)酵 48h 后測菌體干重和輔酶Q10的含量，結(jié)果如圖7。

由圖7可以看出，添加對羥基苯甲酸后，菌體干重比不添加前普遍增加。當對羥基苯甲酸濃度為0.8mg/L時，菌體干重達到116.98g/L，直到對羥基苯甲酸濃度為1.6g/L時，菌體干重均維持在116g/L左右，繼續(xù)增加對羥基苯甲酸濃度，菌體干重開始下降。而輔酶Q10的含量隨著對羥基苯甲酸濃度的增加呈先下降再升高而后又降低的趨勢。當添加濃度為1.2mg/L時，輔酶Q10含量達到最大為49.58mg/L，比不添加時含量增加了7%。這說明在一定濃度范圍內(nèi)，對羥基苯甲酸有利于酵母菌的生長，并促進輔酶Q10的合成。

圖7 對羥基苯甲酸對輔酶Q10發(fā)酵的影響

3 結(jié)論

確定了菌種最佳培養(yǎng)時間為48h，菌體干重為100.78g/L，最佳碳氮源配比為蔗糖4%、酵母浸粉4%，輔酶Q10含量最大為46.32mg/L。添加對羥基甲酸后，輔酶Q10的含量隨著對羥基苯甲酸濃度的增加呈先下降再升高而后又降低的趨勢。當添加濃度為1.2mg/L時，輔酶Q10含量達到最大，為49.58mg/L，比不添加時含量增加了7%。

［1］吳祖芳，翁佩芳，陳堅.輔酶 Q10的功能研究進展［J］.寧波大學學報:理工版，2001，14(2):85－88.

［2］齊繼成.輔酶 Q10保健品的開發(fā)應(yīng)用［J］.中國保健食品，2002，15(6):15－16.

［3］張艷靜，袁啟鵬，梁浩.產(chǎn)輔酶Q10酵母發(fā)酵條件的研究［J］.微生物學通報，2003，30(2):65－69.

［4］郝素麗，吳越，徐康.測定輔酶 Q10方法的研究［J］.中國生化藥物雜志，1998(4):167－171.

［5］袁婧，魏宏.光合細菌產(chǎn)輔酶Q10發(fā)酵條件的研究［J］.氨基酸和生物資源，2003，25(2):24－26.

［6］王春林.輔酶 Q10的提取、分離、鑒定［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1996，27(3):102－104.

Study on adding precursor substances to optimize culture conditions of coenzyme Q10produced by yeast during fermentation process

WEI Bao－dong，MA Ming－h(huán)ui，CUI Yu－can
(Food College，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China)

TS255.1

A

1002－0306(2010)08－0183－04

2009－07－20

魏寶東(1969－)，男，副教授，研究方向:食品制造與保藏。