植物乳桿菌ST-Ⅲ菌株降膽固醇影響因素的研究

陳 帥，劉 娟，王蔭榆，吳正鈞，劉振民

(上海光明乳業技術中心，上海200072)

植物乳桿菌ST-Ⅲ菌株降膽固醇影響因素的研究

陳 帥，劉 娟，王蔭榆，吳正鈞，劉振民

(上海光明乳業技術中心，上海200072)

研究發現植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降低膽固醇作用受膽鹽和膽固醇影響。在培養基中添加不同的膽鹽，能增加ST－Ⅲ菌株降膽固醇能力，依次為牛磺膽酸鈉＞牛膽鹽＞膽酸，當牛膽鹽的添加濃度為3.0g/L時，降膽固醇率達到最高值38.57%;在培養基中添加不同來源和不同濃度的膽固醇，ST－Ⅲ菌株均具有降低作用，但降低能力有差異，依次為羊血清＞雞蛋黃＞卵磷脂－膽固醇膠束溶液，且降低能力受膽固醇的濃度影響較大，當濃度低于0.5mg/mL時，降膽固醇率可維持在40%左右，高于0.5mg/mL時，降膽固醇效果則顯著降低;降膽固醇量在膽固醇濃度為1.0mg/mL時達到最高值307μg/mL，這可能是高濃度膽固醇抑制ST－Ⅲ菌株的生長所致。

植物乳桿菌ST－Ⅲ，降膽固醇，影響因素

Abstract:The influence of cholesterol and bile salts on cholesterol removal ability were tested.The cholesterol removal ability could be increased by adding bile salts into the media，the ability was in order of sodium taurocholic acid ＞ ox bile salt＞ cholic acid.When the concentration of ox bile salt was 3.0g/L，the cholesterol degradation rate reached the highest value 38.57%.ST－Ⅲ could remove cholesterol in different resources of cholesterol，the ability was in the order of sheep serum ＞egg yolk＞ cholesterol－phosphatidylcholine micelles.Cholesterol concentration had influence on its removal by ST－Ⅲ，when the concentration was less than 0.5mg/mL in the medium，the degradation rate maintained around 40%.When higher than 0.5mg/mL，the degradation became decreased with the concentration increased.And the removing content reached the highest value 307μg/mL at the concentration 1.0mg/mL.

Key words:Lactobacillus plantarum ST－Ⅲ;cholesterol removal;influence factors

心血管疾病患病率和死亡率的逐年上升成為引起人類死亡的主要殺手。血清中的膽固醇被認為是誘發冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要危險因素。因此，降低血清中膽固醇的水平直接關系到人類的健康。國內外均有大量研究發現乳酸菌在體內外具有降低膽固醇的益生功能，植物乳桿菌ST－Ⅲ是一株經體內外實驗證實具有降膽固醇作用的菌株。本文通過將植物乳桿菌 ST－Ⅲ接種于MRS－THIO液體高膽固醇培養基，研究其在不同培養條件下對膽固醇的降低情況，了解植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇特性，為進一步研究植物乳桿菌ST－Ⅲ的降膽固醇機理做好前期準備。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌ST－Ⅲ 光明乳業技術中心實驗室保藏;MRS液體培養基、MRS－THIO液體培養基 在MRS－broth中加入0.2%巰基乙酸鈉(THIO);MRSTHIO液體高膽固醇培養基 在MRS－THIO液體培養基中添加一定量的膽固醇源;?；悄懰徕c、水溶性膽固醇 Sigma公司;鄰苯二甲醛 上海醫藥上?；瘜W試劑公司;巰基乙酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司;三氯甲烷 上海試劑一廠。

pH酸度計 奧立龍公司;高速冷凍離心機BECKMAN COULTER公司;厭氧培養箱 RUSKINN公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膽固醇源的制備方法 無菌雞蛋黃液的制備:市售新鮮草雞蛋數枚，無菌操作下在雞蛋一端開口，自然流出蛋清，打開雞蛋得到無菌蛋黃，無菌吸取蛋黃液到無菌羅口瓶，4℃保存作為膽固醇源待用。無菌羊血清的制備:羊血清經0.22μm膜過濾，4℃保存作為膽固醇源待用。卵磷脂－膽固醇膠束溶液的制備:參照文獻［1］。4℃保存，當天使用，0.22μm膜過濾后作為膽固醇源待用。

1.2.2 膽固醇濃度的測定 參照文獻［2］，制得膽固醇標準曲線。采用鄰苯二甲醛法測定膽固醇含量［3］，根據膽固醇標準曲線計算出膽固醇的含量。

1.2.3 樣品處理及降膽固醇率的計算 將待測培養液進行高速冷凍離心(12000r/min，10min，4℃)，得到的上清液直接用于測定膽固醇，膽固醇降低率的計算公式［4］為:

其中:A為各實驗菌株發酵上清液的A550;C為空白對照的A550;D為膽固醇降低率。

1.2.4 膽鹽對植物乳桿菌ST－Ⅲ降膽固醇作用的影響

1.2.4.1 植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株對不同膽鹽的耐受力 實驗分別采用牛膽鹽、膽酸和?；悄懰徕c作為不同膽鹽來檢測植物乳桿菌ST－Ⅲ的膽鹽耐受力。測定方法參照 Gilliland and Walker［2］，在 MRS－THIO培養基中分別添加0.3%(w/v)的膽鹽，空白對照組為MRS－THIO培養基，1%量接入植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株后37℃培養。每隔1h測定培養液在620nm處的吸光值及pH，以A620到達0.3的時間差作為菌株膽汁耐受力的評判依據。

1.2.4.2 不同膽鹽對植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇作用的影響 參考Liong M.T.的方法［5］，將植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株接種于分別添加0.3%牛膽鹽、膽酸和?；悄懰徕c的MRS－THIO液體高膽固醇培養基(培養基中膽固醇濃度約300μg/mL)，37℃培養24h后進行膽固醇含量測定并計算降低率。

1.2.4.3 膽鹽濃度對植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇作用的影響 將植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株接種于不同牛膽鹽濃度的MRS－THIO液體高膽固醇培養基，培養基中牛膽鹽的終濃度分別為 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L［6］，37℃培養 24h 后測定膽固醇含量并計算降低率。

1.2.5 膽固醇對植物乳桿菌ST－Ⅲ降膽固醇作用的影響

1.2.5.1 膽固醇源對植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇作用的影響 將植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株接種于含有0.3%牛膽鹽的MRS－THIO液體培養基，在培養基中分別加入羊血清、雞蛋黃以及膽固醇膠束溶液作為膽固醇源，37℃培養24h后測定膽固醇含量并計算降低率。

1.2.5.2 膽固醇濃度對植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇作用的影響 將植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株接種于含有0.3%牛膽鹽的MRS－THIO液體高膽固醇培養基，膽固醇膠束溶液調節培養基中膽固醇含量，使之分別為 0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL［7］，37℃ 培養 24h 后測定膽固醇含量并計算降低率。

2 結果與討論

2.1 膽固醇標準曲線

以膽固醇濃度對 A550作圖，得到膽固醇標準曲線。

圖1 膽固醇濃度的標準曲線

2.2 植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株對不同膽鹽的耐受力

表1為在MRS－THIO培養基中添加牛膽鹽、膽酸和?；悄懰徕c時植物乳桿菌ST－Ⅲ的生長情況，以不添加任何膽鹽的MRS－THIO培養基作為空白對照。其中膽酸為游離膽酸，?；悄懰徕c為結合型膽鹽，牛膽鹽則為游離膽酸與結合型膽鹽的混合物。從表1中可以看出，在含不同膽鹽的培養基中ST－Ⅲ菌株所表現出的耐膽鹽能力不同，對牛磺膽酸鈉的耐受力最強，與對照組相比遲滯時間僅為0.31h;對牛膽鹽與膽酸的耐受力較弱，遲滯時間分別為3.75h與3.42h。雖然含膽酸的培養基初始pH最低，但這不是導致ST－Ⅲ菌株生長緩慢的主要原因，Liong［5］也在其實驗中發現不同的初始pH對于菌體生長以及耐膽鹽能力的影響非常小。由此，可以得知植物乳桿菌ST－Ⅲ對結合型膽鹽的耐受能力較強，而對游離膽酸以及混合型膽鹽的耐受能力較弱。

表1 植物乳桿菌ST－Ⅲ對不同膽鹽的耐受能力

2.3 不同膽鹽對降膽固醇作用的影響

Klaver［8］等研究者提出，細菌從培養基中去除膽固醇是游離膽酸和膽固醇在pH低于5.5時共同沉淀的結果，乳酸菌通過水解結合型膽鹽轉變為游離膽酸，因后者的溶解度降低與膽固醇發生共同沉淀作用，因此，培養基中的膽鹽存在與否，膽鹽的結合狀態都會影響乳酸菌的降膽固醇作用。實驗選用三種不同類型的膽鹽來研究膽鹽對植物乳桿菌ST－Ⅲ降膽固醇作用的影響。

從圖2中可以看出，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株在含不同膽鹽培養基中的降膽固醇能力雖有所不同，但差別不大。其中對結合型膽鹽－?；悄懰徕c培養基的降膽固醇作用最強，降解率可達44.0%;其次為混合型膽鹽培養基，降解率為39.7%;游離膽酸－膽酸培養基降膽固醇作用較弱，但也達到了32.6%。結合植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株對不同膽鹽的耐受力進行比較，在生長狀態最好的?；悄懰徕c培養基中降膽固醇能力最強，而在生長較弱的膽酸和牛膽汁中降膽固醇能力較弱。這表明植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇作用與菌體生長存在著一定的相關性;但不同膽鹽對植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇作用影響不大，因此我們推測植物乳桿菌ST－Ⅲ的降膽固醇作用以同化作用為主，但這還需要進一步的實驗來證實。

圖2 ST－Ⅲ在不同膽鹽培養基中的降膽固醇能力

2.4 膽鹽濃度對降膽固醇作用的影響

從圖3中可以看出，當培養基中不含膽鹽時，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株具有一定的降膽固醇作用，但效果不明顯;當培養基加入膽鹽后，降膽固醇作用呈現先升高后降低的趨勢，當培養基中膽鹽濃度為3.0g/L時，降膽固醇作用最強，降膽固醇率可達38.57%，此后隨著培養基中膽鹽濃度的增高降膽固醇作用開始降低，這有可能是由于膽鹽濃度過高抑制了菌體生長所致。但這一現象并不能說明植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇方式以沉淀作用為主，有研究人員發現，在其培養的14株乳桿菌中，在不添加膽鹽培養時，上清液膽固醇濃度幾乎沒有變化，在沒有膽鹽存在的條件下同化作用和共沉淀作用均未發生。提出膽鹽的存在不僅能促使膽固醇共沉淀作用的發生，還能增加細胞膜通透性，利于膽固醇的同化作用［9］。由此我們推測對于植物乳桿菌ST－Ⅲ，隨著膽鹽濃度的增高不僅沉淀作用增強，同化作用也得到提高。這在后期實驗中也得到了證實，在含有0.3%牛膽鹽的MRS－THIO高膽固醇培養基中培養24h后，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的同化作用降膽固醇率達到25.5%，明顯高于不添加膽鹽培養的降膽固醇率7.79%，同化作用增強。

2.5 膽固醇源對降膽固醇作用的影響

降膽固醇乳酸菌在篩選過程中，膽固醇源的不同導致菌體的降膽固醇能力有所差別。文獻中所涉

及到的膽固醇源有血清［10－11］、雞蛋黃［12－13］、卵磷脂－膽固醇膠束溶液［1，6，14］、膽固醇乙醇溶液［15］等，還有研究直接利用膽固醇含量高的食品基質(奶油)來作為培養基篩選目的菌種［16－17］。由于膽固醇在水中的溶解性極差，一般的方法無法使其在培養基中均勻分布，而血清與雞蛋黃屬于天然高膽固醇產物，其富含的其他物質可幫助膽固醇均勻分布于培養基中，是培養基中膽固醇的較適合來源。因此本實驗選用血清、蛋黃和卵磷脂－膽固醇膠束溶液作為不同的膽固醇源測定植物乳桿菌ST－Ⅲ的降膽固醇能力。

圖3 膽鹽濃度對植物乳桿菌ST－Ⅲ降膽固醇作用的影響

從圖4中可以看出，在膽固醇初始濃度相同的條件下，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株在不同膽固醇源中的降膽固醇能力有所差別，降膽固醇能力依次為羊血清＞雞蛋黃＞卵磷脂－膽固醇膠束溶液，這可能是由于血清和蛋黃中含有的其他物質引起的。從圖中還可以看出隨著溶液中膽固醇初始濃度的增大，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇含量也隨之升高，膽固醇的降低率基本恒定，這說明植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株具有較穩定的降低膽固醇能力。

圖4 ST－Ⅲ在不同膽固醇源中的降膽固醇能力

2.6 膽固醇對ST－Ⅲ菌株生長曲線的影響

圖5所顯示的是植物乳桿菌ST－Ⅲ在添加與不添加膽固醇膠束溶液兩種狀態下的生長曲線以及培養24h過程中降低膽固醇率的變化。隨著培養時間的延長，降膽固醇率呈現不斷上升的趨勢。從圖中可以看出，在培養4h后，添加膽固醇培養的植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株較未添加相比生長較快，在達到穩定期時，A620處的吸光值已明顯高于不含有膽固醇培養基的植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株，這說明膽固醇對植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的生長具有促進作用。從圖中還可以看出，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇作用與菌體生長存在著一定的相關性，當植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株進入對數生長期，降膽固醇作用明顯增強，我們推測植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇作用極有可能是菌株代謝產物的作用結果。

2.7 膽固醇濃度對降膽固醇作用的影響

膽固醇濃度對降膽固醇作用影響的實驗結果見圖6，膽固醇初始濃度不同，植物乳桿菌ST－Ⅲ所表現出的降膽固醇率以及降膽固醇含量也有所差異。從圖中可以看出，當膽固醇初始濃度較低時，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇率維持在一個恒定的范圍內，在40%左右;當濃度大于0.5mg/mL時，降膽固醇率開始呈下降趨勢;而降膽固醇量一開始則隨著膽固醇濃度的增大而增大，當濃度達到1.0mg/mL時降低量達到最大值307μg/mL，此后則不再隨著濃度的升高而增大，開始呈降低趨勢，這可能是膽固醇濃度過高抑制了菌體的生長代謝所引起的。雖然降膽固醇含量在濃度為1.0mg/mL時達到最大值，但從此處的降膽固醇率可以看出，菌體生長已經受到一定的抑制作用而使降膽固醇率有所下降，但由于培養基中膽固醇初始濃度高，以致于降膽固醇含量在濃度1.0mg/mL達到最高值。pH的測定也表明高濃度膽固醇會抑制菌體生長，培養24h后分別測pH發現，低濃度膽固醇的pH在4.22～4.29之間;高濃度膽固醇的pH則依次為4.48、4.67、4.89，隨著膽固醇初始濃度的增高，pH相應降低，菌株生長受抑制程度加深。

圖5 ST－Ⅲ的生長曲線與降膽固醇之間的關系

圖6 不同膽固醇濃度對膽固醇降解率的影響

3 結論

植物乳桿菌ST－Ⅲ對不同膽鹽的耐受力依次為?；悄懰徕c＞膽酸＞牛膽鹽;在培養基中添加不同膽鹽植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇能力不同，依次為?；悄懰徕c＞牛膽鹽＞膽酸;當培養基中不添加膽鹽時植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株具有一定的降膽固醇能力，但作用效果不強;隨著培養基中膽鹽濃度的增高，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇能力呈先升高后降低的趨勢，當膽鹽濃度為3.0g/L時降膽固醇率達到最高值38.57%。

植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株具有穩定的降膽固醇能力，對不同來源的膽固醇均具有降膽固醇作用，能力依次為羊血清＞雞蛋黃＞卵磷脂－膽固醇膠束溶液;在膽固醇濃度對其降膽固醇作用影響的研究發現，當膽固醇濃度低于為0.5mg/mL時，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇率恒定在40%左右，當濃度高于0.5mg/mL時，降膽固醇能力隨著膽固醇濃度的增大而降低;在濃度為1.0mg/mL時，降膽固醇量達到最大值307μg/mL。

植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇作用與菌體生長存在著一定的相關性，菌體生長處于優勢則降膽固醇能力強;膽鹽的結合狀態對植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇作用的影響差別較小;這都暗示著植物乳桿菌ST－Ⅲ的降膽固醇作用以同化作用為主，當然這還需進一步實驗證實。

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Study on influence factors of cholesterol removal by Lactobacillus plantarum ST－Ⅲ strain

CHEN Shuai，LIU Juan，WANG Yin－yu，WU Zheng－jun，LIU Zhen－min
(Technical Center，Bright Dairy ＆ Food Co.，Ltd.，Shanghai 200072，China)

TS201.2

A

1002－0306(2010)08－0088－04

2009－04－27

陳帥(1984－)，男，碩士研究生，研究方向:食品微生物。

國家高技術研究發展計劃(2007AA10Z353)。