脈沖輻解研究橙皮苷、柚皮苷抗氧化活性及機理探討

鮑小丹，許 晨，黃 娟，馬建華，*

(1.集美大學生物工程學院，福建廈門361021;2.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門361021)

脈沖輻解研究橙皮苷、柚皮苷抗氧化活性及機理探討

鮑小丹1，許 晨2，黃 娟1，馬建華1，*

(1.集美大學生物工程學院，福建廈門361021;2.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門361021)

利用脈沖輻解瞬態吸收光譜技術研究了橙皮苷和柚皮苷與羥基自由基(·OH)的瞬態反應機理和動力學。研究結果表明:N2O飽和的4.9×10－5mol·L－1的橙皮苷、5.2×10－5mol·L－1的柚皮苷水溶液經脈沖輻解分別產生了橙皮苷酚氧自由基(特征瞬態吸收峰320nm)和柚皮苷酚氧自由基(特征瞬態吸收峰310～340nm);反應的表觀反應速率常數分別為8.38×105s－1和6.48×105s－1。橙皮苷和柚皮苷可有效清除羥基自由基。實驗還從結構上探討了橙皮苷和柚皮苷的抗氧化活性機制。

橙皮苷，柚皮苷，脈沖輻解，作用機理

Abstract:Respective transient reactions of hesperidin and naringin with hydroxyl radicals and kinetics were investigated by pulse radiolysis.Results showed that N2O－saturated aqueous solution of hesperidin(4.9 ×10－5mol·L－1)and naringin(5.2 × 10－5mol· L－1)generated the phenoxy radical after the pulse radiolysis.The respective transient absorption peak of hesperidin and naringin were at 320nm and 310～340nm.The apparent reaction rate constants of hesperidin and naringin were 8.38 ×105s－1and 6.48 ×105s－1，respectively.Hesperidin and naringin had significant hydroxyl radicals scavenging effect.The probable mechanisms of antioxidants activity in structual aspects were also discussed.

Key words:hesperidin;naringin;pulse radiolysis;mechanism of antioxidation

生物體內過多的羥基自由基(半衰期為10－9s)是引起DNA氧化損傷、生物變異和組織癌變的主要原因之一［1］。因為它能造成DNA空間構象的改變、DNA單雙鏈的斷裂損傷、DNA－蛋白質交聯、DNADNA交聯等反應，單鏈斷裂中約10%是由羥基自由基引起的［2］。探尋能夠有效清除羥基自由基的天然活性物質一直是生物醫學、輻射生物學等領域的研究熱點之一。橙皮苷和柚皮苷屬二氫黃酮類化合物(Flavanones)，廣泛存在于柑橘類水果中［3－4］(其分子式見圖1)，具有良好的藥學性質和醫學應用，包括抗炎、抗癌、抗潰瘍、防止骨質疏松、減少血清和肝臟中類脂含量等生物功效［4－7］。但有關其生物功能的分子作用機制方面的研究目前報道不多，尤其利用時間分辨脈沖輻解技術研究橙皮苷和柚皮苷清除羥基自由基的性能、反應動力學的研究尚未見報道。本文采用脈沖輻解瞬態吸收光譜技術，研究了橙皮苷和柚皮苷清除羥基自由基的反應活性及其動力學特征，并從結構上探討了它們的抗氧化活性機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橙皮苷和柚皮苷 由國家海洋局第三海洋研究所提供;過硫酸鉀(K2S2O8) 天津市福晨化學試劑廠，化學純，重結晶提純后使用;NaOH 上海化學試劑總廠，分析純;特丁醇 武漢遠城科技發展有限公司，分析純，所有溶液都用三重蒸餾水新鮮配制;N2、N2O 均為含量大于99.99%的高純氣體。

圖1 橙皮苷和柚皮苷結構式

脈沖輻解所用的電子加速器 為中國科學院上海應用物理研究所10MeV電子直線加速器，電子脈沖寬度為8～10ns可調，單脈沖劑量為10～40Gy可調，脈沖電流為 2～3A，以空氣飽和的 0.01mol·L－1KSCN水溶液作為化學劑量計，取 ε［(SCN)·］(480nm)=7600dm3·mol－1·cm－1;時間分辨吸收光譜系統采用500W氙燈為分析光源，分析光以垂直于電子束的方向通過20mm石英樣品池，經44W的單色儀分光，經IP28光電倍增管轉變為電信號，電信號由HP54510B 300Hz瞬態記錄儀經過A/D數字示波器轉換成數字信號，并記錄儲存于計算機內，以自編軟件進行動力學數據處理［8－9］。

1.2 實驗方法

1.2.1 橙皮苷和柚皮苷水溶液的脈沖輻解實驗 配制濃度為4.9×10－5mol·L－1的橙皮苷水溶液和5.2×10－5mol·L－1的柚皮苷水溶液，通 N2O 氣體飽和20min后，分別進行脈沖輻解實驗。

1.2.2 橙皮苷和柚皮苷酚氧自由基的確認 配制含3.92 × 10－5mol·L－1的橙皮苷、2 × 10－2mol·L－1的K2S2O8及 2 × 10－2mol·L－1的特丁醇，用 N2飽和20min，進行脈沖輻解實驗。

配制含 4.16 ×10－5mol·L－1的柚皮苷、2 × 10－2mol·L－1的 K2S2O8及 2 ×10－2mol·L－1的特丁醇，用N2飽和20min，進行脈沖輻解實驗。

2 結果與討論

2.1 羥基自由基的產生［10］

由自由基的化學輻射產率可知，產生的H·和H2O2的數量遠遠小于·OH的數量。所以，在研究的波長范圍內，由光學儀器所觀察到的信號主要是由·OH和反應物反應所引起的。

2.2 橙皮苷和柚皮苷水溶液的脈沖輻解

黃酮類物質能和脈沖輻解產生的羥基自由基快速反應，因為羥基自由基和芳香化合物有很高的反應活性。它們主要攻擊黃酮類化合物的酚羥基，生成酚氧自由基［11］。由圖2所示，由N2O飽和的橙皮苷水溶液經脈沖輻解得到的在320nm處的吸收帶應歸屬為橙皮苷酚羥基與羥自由基反應生成的酚氧自由基。由于柚皮苷在310～340nm之間的生成衰減曲線幾乎重合，所以斷定310～340nm處的吸收峰為柚皮苷酚羥基與羥自由基反應生成的酚氧自由基。因為A環與不成對電子無效的聯結，導致橙皮苷和柚皮苷自由基中5－OH的去質子化對自由基的吸收光譜沒有影響［12］。

圖2 N2O飽和的橙皮苷和柚皮苷水溶液分別脈沖輻解5μs和3μs后獲得的瞬態吸收光譜圖

圖3和圖4分別是橙皮苷和柚皮苷在各個吸收峰的衰減動力學曲線。橙皮苷在320nm和400nm處的動力學衰減曲線不相同，這表明至少有2個瞬態產物同時生成，柚皮苷也是一樣。通過對比文獻［13］還可以看出，橙皮苷與·OH反應在320nm處生成了hesperidin－3’－O·。400nm 處的吸收在5μs內達到最高點，隨后稍稍衰減，最后在可測定的時間段里基本維持不變，由此可以推測該瞬態產物可能是一長壽命的［hesperidin－OH］·中間體。這樣，橙皮苷與·OH反應式可推測為:

hesperidin+·OH→［hesperidin－OH］· +Hesperidin－3’－O·

同理，柚皮苷與·OH反應式可推測為:

naringin+·OH→［naringin－OH］· +Naringin－4’－O·

橙皮苷和柚皮苷對羥基自由基清除作用的表觀反應速率常數可根據酚氧自由基的生成曲線(圖3和圖4)分別進行反應動力學擬合處理而獲得。由于羥基自由基的濃度遠低于橙皮苷和柚皮苷的濃度，因而可按準一級反應動力學求得表觀反應速率常數。橙皮苷和柚皮苷與羥基自由基反應的表觀速率常數分別為8.38 ×105s－1和6.48 ×105s－1。

2.3 橙皮苷和柚皮苷酚氧自由基的確認

從圖5中可以看出，該反應體系脈沖輻解1μs時在480nm處出現了一強吸收峰，并迅速衰減，其特征與文獻報道的硫酸根陰離子自由基(·)吸收峰一致［14］，當歸屬于體系所產生·的瞬態吸收。緊續其后，330nm處出現另一瞬態吸收峰，其在7μs后達到最大值，該吸收峰歸屬于橙皮苷的酚氧自由基特征吸收。圖7為該反應體系所產生的硫酸根陰離子自由基(·)在480nm處以及橙皮苷的酚氧自由基在330nm處的生成－衰減動力學曲線。由圖7可以看出，酚氧自由基的生成曲線明顯緩于·的生成曲線，可以推測體系中首先產生·，隨后氧化橙皮苷，使橙皮苷陽離子自由基脫質子反應，最終生成橙皮苷酚氧自由基。對于柚皮苷來說，產生柚皮苷酚氧自由基的特征吸收在330nm處(見圖6)，在此不再重復敘述。

圖3 N2O飽和的橙皮苷水溶液脈沖輻解后分別在320nm和400nm處記錄的生成和衰減曲線

圖4 N2O飽和的柚皮苷水溶液脈沖輻解后分別在320nm和400nm處記錄的生成和衰減曲線

圖5 N2飽和的含有特丁醇和過硫酸鉀的橙皮苷水溶液分別脈沖輻解1μs和7μs后獲得的瞬態吸收光譜圖

圖6 N2飽和的含有特丁醇和過硫酸鉀的柚皮苷水溶液分別脈沖輻解0.5μs和11μs后獲得的瞬態吸收光譜圖

其反應可歸納如下:

橙皮苷和柚皮苷均屬黃酮類物質。黃酮類物質可包括黃酮、黃烷酮、異黃酮、黃酮醇、黃烷酮醇等多種類型。黃酮類物質的基本結構是黃烷母核(如圖9所示)，由分布在三個環中(C6－C3－C6)的15個碳原子構成，被標為A，B，C。不同類型的黃酮類物質氧化性能和取代C環的形式各異，同一類型不同個體的黃酮類物質取代A環和B環的形式不同［1］。黃酮類物質的抗氧化作用機理與它們的結構活性息息相關，有三個結構基團對于自由基的清除具有重要的決定作用［15］:a.對與所有2，3－單鍵的黃酮類物質，B環中的鄰苯二酚結構是自由基的攻擊點。而鄰苯二酚基團參與電子的轉移，也賦予酚氧自由基較高的穩定性;b.2，3－雙鍵跟4－氧代功能基團的聯結，對于從B環的電子轉移有重要作用;c.3－羥基和5－羥基的存在可以使自由基的清除潛能最大化并能強烈吸收自由基。所以，黃烷酮在清除自由基時，主要是B環上的鄰苯二酚結構在起決定性作用，如果把B環的3’－羥基移去(如柚皮苷)，則抗氧化能力下降。單個的4’－羥基基團可用于清除自由基，若被甲基化(如橙皮苷)，則削弱了其清除能力。不過由于橙皮苷中4’－甲氧基的取代能活化3’－OH，比柚皮苷中4’－OH 的活性要強［16］，故其清除自由基的能力比柚皮苷強。本實驗所測橙皮苷、柚皮苷分別與羥基自由基反應的表觀速率常數的差異也證實了這一點。

圖7 N2飽和的含有特丁醇和過硫酸鉀的橙皮苷水溶液脈沖輻解后分別在330nm和480nm處記錄的生成和衰減曲線

圖8 N2飽和的含有特丁醇和過硫酸鉀的柚皮苷水溶液脈沖輻解后分別在330nm和450nm處記錄的生成和衰減曲線

圖9 黃酮類物質的基本結構

對于抗氧化活性物質，其抗氧化活性機理除了抑制活性氧的形成和清除活性氧之外，還包括螯合一些能促進自由基生成的微量元素［17］，所以它們的作用效果往往是雙重的(比如黃酮類物質)。黃酮類物質中對于微量元素的結合部位是在B環的鄰苯二酚部分，C環上的3－羥基、4－氧代基團和C環和A環之間的4－氧代、5－羥基基團。不過對于金屬螯合能力，3－OH和鄰苯二酚結構比5－OH要重要，像柚皮苷那樣只能通過5－OH、4－氧代部分來螯合的物質是弱的金屬螯合劑［16］，不過通過5－OH來螯合的化合物穩定性更好［18］。由此，可以推測橙皮苷的金屬螯合能力略強于柚皮苷。盡管越來越多的研究表明，黃酮類物質在體外具有抗氧化活性，在體內的抗氧化效果卻知之甚少，這可能歸咎于人們對其在人體內的生物學活性了解的不夠詳盡。對于抗氧化活性而言，橙皮苷和柚皮苷A環上糖基化削弱了自由基的清除能力。不過數據顯示，黃烷酮(flavanones)的生物學活性與糖苷部分相關［19］。由健康志愿者口頭攝入的柚皮苷也是以糖苷的形式被人體吸收［20］。

3 結論

橙皮苷和柚皮苷能快速清除羥基自由基。瞬態反應均產生了穩定的酚氧自由基;二者與羥基自由基反應的表觀速率常數分別為8.38×105、6.48×105s－1。橙皮苷和柚皮苷是天然有效的自由基清除劑。

［1］Pietta Pier－ Giorgio.Flavonoids as Antioxidants［J］.J Nat Prod，2000，63(7):1035－1042.

［2］Cadet J，Delatour T，Douki T，et al.Hydroxyl radicals and DNA base damage［J］.Mutation Research，1999，424:9－21.

［3］Nijveldt R J，Nood E van，et al.Flavonoids:a review of probable mechanisms of action and potential applications［J］.American Journal of Clinical Nutrition，2001，74(4):418 －425.

［4］Garg A，Garg S，Zaneveld L J，et al.Chemistry and pharmacology ofthe citrus bioflavonoid hesperidin［J］.Phytotherapy Research，2001，15(8):655－669.

［5］Tanaka T，Makita H，Kawabata K，et al.Carcinogenesis［M］.Oxford University Press，1997，18:957－965.

［6］Kanaze F I，Gabrieli C，Kokkalou E，et al.Simultaneous reversed－phase high－performance liquid chromatographic method for the determination of diosmin，hesperidin and naringin in different citrus fruit juices and pharmaceutical formulations［J］.Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2003，33(2):243－249.

［7］Chiba H，Uehara M，Wu J，et al.Hesperidin，a Citrus Flavonoid，Inhibits Bone Loss and Decreases Serum and Hepatic Lipids in Ovariectomized Mice［J］.J Nutr，2003，133:1892－1897.

［8］朱大章，孫冬梅，蔣忠良，等.脈沖輻解研究喹啉和異喹啉與瞬態粒子的反應［J］.物理化學學報，2008，24(12):2321－2326.

［9］Yao S D，Zhang J S，Lin N Y，et al.Nanosecond pulse radiolysis studies in China［J］.Radiation Physics and Chemistry，1995，46(1):105.

［10］Mvula E，Schuchmann M N，Sonntag C.Reactions of phenol－OH－adduct radicals.Phenoxyl radical formation by water elimination vs.oxidation by dioxygen［J］.J Chem Soc，Perkin Trans，2001(2):264－268.

［11］Davies M J，Forni L G，Willson R L.Vitamin E analogue Trolox C［J］.Biochem J，1988，225:513－522.

［12］Jovanovic S V，Steenken S，Tosic M，et al.Flavonoids as Antioxidants［J］.J Am Chem Soc，1994，116(11):4846－4851.

［13］于文利，王文峰，趙亞平，等.脈沖輻解研究葛根素對自由基的清除活性［J］.中國科學(B 輯)，2003(2):172－175.

［14］馬建華，錢素平，等.綠原酸對脫氧鳥苷酸氧化性羥基加和物的快速修復［J］.中國科學(B 輯)，1998(6):561－565.

［15］BorsW，HellerW，MichelC，etal.Flavonoidsas antioxidants:determination of radical－scavenging efficiencies［J］.Methods in Enzymology，1990，186:343－355.

［16］Van Acker Saskia A B E ，Van Den Berg Dirk－jan ，Tromp Michèl N J L，et al.Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids［J］.Elsevier Science B V，1996，20(3):331－342.

［17］Halliwell B，Gutteridge J M C.Free Radicals in Biology and Medicine［M］.Oxford University Press:Oxford，1998.

［18］Morel I，Lescoat G，Cogrel P.Antioxidant and iron－chelating activities of the flavonoids catechin，quercetin and diosmetin on iron－loaded rat hepatocyte cultures［J］.Elsevier Science，1993，45(1):13－19.

［19］Ameer B，Weintraub R A，Johnson J V，et al.Flavanone absorption after naringin，hesperidin，and citrus administration［J］.Clinical Pharmacology ＆ Therapeutics，1996，60:34－40.

［20］Felgines C，Texier O，Morand C，et al.Bioavailability of the flavanone naringenin and its glycosides in rats［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，279(6):1148－1154.

Study on antioxidant activity and mechanism of hesperidin and naringin by pulse radiolysis

BAO Xiao－dan1，XU Chen2，HUANG Juan1，MA Jian－hua1，*
(1.College of Bioscience Engineering，Jimei University，Fujian 361021，China;2.Third Institute of Oceanography，National Bureau of Oceanography，Fujian 361021，China)

TS255.1

A

1002－0306(2010)08－0115－04

2009－09－22 *通訊聯系人

鮑小丹(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:天然產物的抗氧化活性研究。

福建省自然科學基金(2009J01032);福建省教育廳基金(JA08136);廈門市集美區科技局科技計劃項目(350211Z20092C01);集美大學中青年創新團隊專向基金(2006A003)。